Живая аптека и кислород: оксигенация имплантируемых терапевтических клеток
Организм человека — это сложный механизм, состоящий из множества взаимодействующих элементов. Это сравнение мы слышали миллион раз и столько же раз еще услышим. И как в любом устройстве, в организме случаются поломки. Некоторые типы заболеваний излечиваются оперативным вмешательством, некоторые нуждаются в непродолжительном приеме тех или иных препаратов. Но есть случаи, когда для лечения недуга нужен постоянный поток веществ определенного типа. Трансплантация устройств с терапевтическими клетками внутри (так называемая «живая аптека») может стать решением этой проблемы. Однако, клетки внутри устройства, как и любые другие, нуждаются в кислороде, получать который из организма носителя они не могут ввиду архитектуры устройства. Ученые из Северо-Западного университета (США) разработали систему, которая будет вырабатывать кислород внутри устройства, значительно продлевая жизнь терапевтических клеток без какого-либо вреда для пациента. Из чего состоит система, как она работает, и насколько она эффективна? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.
Основа исследования
Трансплантация терапевтических клеток в полупроницаемых устройствах в виде живой аптеки потенциально может помочь в лечении ряда заболеваний, таких как эндокринные, аутоиммунные, рак и неврологическая дегенерация. Для применения клеточной терапии на людях требуется высокая плотность клеток, чтобы можно было создавать миниатюрные устройства, имеющие терапевтическую ценность. Исследования показали, что инкапсулированные клетки могут выживать при плотности 6–10 тысяч клеток на мм3 при имплантации для лечения диабета 1 типа и псориаза. Однако поддержание эффективности таких плотно упакованных клеток в течение длительного времени является сложной задачей из-за ряда факторов, таких как иммунный ответ хозяина и недостаточная доступность питательных веществ и растворенного кислорода. Решить проблему иммунореактивности может иммуноизоляция и защита клеток с использованием инкапсулирующих мембран или инженерных биоматериалов. Но вот проблема питательных веществ и кислорода куда более сложная.
Кислород рассматривается как ограничивающий фактор, влияющий на жизнеспособность и эффективность клеток. Из-за предела диффузии кислорода в нативной ткани каждая клетка находится в пределах около100 мкм от кровеносного капилляра, чтобы обеспечить адекватное снабжение кислородом. Трансплантированные экзогенные клетки или ткани требуют образования новых кровеносных сосудов или дополнительной оксигенации. Задержка васкуляризации ограничивает успех трансплантации, а также функцию трансплантированных клеток. Дефицит кислорода в трансплантированных клетках обусловлен недостаточным напряжением кислорода в месте имплантации, врожденным большим потреблением кислорода клетками (т.е. метаболической потребностью), высокой плотностью клеток, дополнительными барьерами для диффузии кислорода (т.е. мембраны или образование инкапсулирующей фиброзной ткани).
Чтобы справиться с гипоксическим стрессом трансплантированных клеток, были исследованы различные стратегии усиления доставки экзогенного кислорода. Две основные стратегии, используемые для смягчения дефицита кислорода, можно разделить на активные и пассивные методы. Активные методы включают высвобождение кислорода посредством управляемого извне механизма, например, доставку газообразного кислорода к трансплантированным клеткам (т.е. островковым клеткам). Пассивные методы основаны на постепенном высвобождении кислорода посредством нерегулируемых или саморегулируемых механизмов, например, с помощью специальных платформ для увеличения кислородного обмена со средой имплантации или высвобождения кислорода из пероксидов металлов. Хотя эти подходы способны поддерживать трансплантированные клетки, они ограничены в контроле высвобождения кислорода, сроке службы доступного кислорода и ограниченной плотности поддерживаемых клеток.
Электрохимический электролиз воды для производства кислорода является многообещающим подходом к обеспечению клеток кислородом. Однако его демонстрация in vivo была ограничена из-за неправильного выбора материалов, направленных на эффективное расщепление воды, использования громоздкой и сложной электроники для расщепления воды и ограниченной энергии. Хотя электрокаталитическое расщепление воды широко распространено в исследованиях возобновляемых источников энергии, его применение в тканевой инженерии ограничено из-за слабого расщепления воды в нейтральных средах. Зависимый от pH характер окислительно-восстановительных реакций воды и присущая ей термодинамическая стабильность еще больше препятствуют электрохимическому разложению воды в физиологических средах, поскольку в них отсутствуют необходимые активные соединения, такие как H+ и OH-. Кроме того, нейтральный pH требует более высокого перенапряжения, что приводит к увеличению энергопотребления и потенциальному риску образования токсичных побочных продуктов, таких как хлор в результате окисления хлоридов. Следовательно, крайне важно использовать электрокатализаторы, которые могут эффективно снизить энергетический барьер, будучи при этом биосовместимыми и высокоселективными для реакции выделения кислорода (OER от oxygen evolution reaction) при нейтральном pH.
Оксид иридия является эталонным электрокатализатором для OER благодаря своей исключительной каталитической эффективности и стабильности. В отличие от других электрокаталитических материалов, оксид иридия сохраняет свою мощную каталитическую активность в кислых средах, где молекулы воды непосредственно участвуют в OER. Это делает его пригодным в качестве электрокатализатора в физиологических средах, поскольку электрохимия OER принципиально схожа с нейтральными и кислыми условиями. Пленки оксида иридия можно производить с наноскопической морфологией, что позволяет миниатюризировать устройства и увеличить площадь электрохимической поверхности, доступную для электрокатализа.
В рассматриваемом нами сегодня труде ученые описывают высококонтролируемую платформу электрокаталитического оксигенатора (ecO2), предназначенную для безопасной поддержки имплантированных терапевтических клеток. Ученые использовали наноструктурированную пленку распыленного оксида иридия (SIROF от sputtered iridium oxide film) для улучшения кинетики OER и снижения энергетических затрат на производство кислорода.
Результаты исследования
Изображение №1
Платформа ecO2 включает в себя специализированную камеру для размещения терапевтических клеток высокой плотности и интегрированную систему оксигенации для обеспечения кислородной поддержки, имплантированную в легкодоступные и клинически значимые места, такие как подкожные и внутрибрюшинные участки (1a). Генерация кислорода достигается за счет электролиза воды и точно регулируется с помощью электронной системы с беспроводным управлением и питанием от батареи, хотя с помощью ecO2 можно легко реализовать полностью безбатарейную технологию беспроводного питания.
В качестве ключевого материала для производства кислорода в системе был использован распыленный оксид иридия (SIROF), который является высокоактивным и биосовместимым электрокатализатором окисления воды. Чтобы обеспечить равномерную доставку кислорода к имплантированным клеткам, был разработан массив различной геометрии и проведена оценка распределение генерируемого из них кислорода методом конечных элементов (FEA от finite element analysis) (1b). Учитывая симметрию спроектированного электрода, были изучены двумерные профили кислорода для поперечного сечения электрода. На основе симуляционных исследований, демонстрирующих равномерный профиль распределения кислорода, было решено использовать массив, состоящий из точечных источников (1c).
В то время как анод SIROF имеет меньшую геометрическую площадь поверхности по сравнению с платиновым катодом, наноструктурированный SIROF усиливает каталитическую активность оксида иридия в реакции выделения кислорода, тем самым способствуя увеличению электрохимической площади поверхности. Ученые максимально увеличили площадь поверхности катода, на которой выделяется водород, чтобы минимизировать плотность тока и предотвратить образование пузырьков в результате катодной реакции, которая происходит из-за плохой растворимости водорода в воде.
Синтезированные катализаторы ecO2 обладают нанопористой структурой, которая позволяет запускать электрокаталитические реакции выделения кислорода при более низком потенциале (1d), тем самым снижая требования к мощности для электроники, а также предотвращая электрохимические побочные реакции, которые могут возникнуть при приложении высокого потенциала.
Анализ поверхности показал наличие рутила IrO2 с вкраплениями аморфных областей, а также существование электрокаталитически активных Ir4+ и кислородных вакансий для OER. Комбинация высокоактивного аморфного оксида иридия и стабильного кристаллического IrO2 позволила поддерживать имплантируемые клетки за счет постоянной доставки кислорода посредством электрохимического расщепления воды.
Изображение №2
Затем ученые провели сравнение активности и стабильности каталитического электрода на основе SIROF и платинового электрода в 1 × электролите PBS (pH = 7.4). Сканирование вольтамперометрии с линейной разверткой (LSV от linear sweep voltammetry) в анодном направлении выявило характерный сигнал активации оксида иридия в OER примерно при 1.6 В по сравнению с RHE. Катализатор SIROF продемонстрировал значительно более низкое перенапряжение 395 ± 18 мВ по сравнению с перенапряжением платинового электрода 565 ± 10 мВ (2a), что представляет собой снижение энергетических затрат на производство кислорода при каталитической активности SIROF. Более высокий ток, наблюдаемый для SIROF при том же приложенном потенциале, предполагает его способность достигать энергоэффективной электрокаталитической генерации кислорода в биоэлектронных приложениях.
Стабильность SIROF исследовали при непрерывном хроноамперометрическом режиме с использованием двухэлектродной установки при напряжении 1.7 В в течение 14 дней. Для мониторинга изменения каталитической активности кривые LSV в 3-электродной и 2-электродной установке собирали каждые 24 часа.
Выделения кислорода для SIROF практически не изменилось в течение 14-дневного эксперимента. Это указывает на то, что катализатор не претерпел значительной деградации при постоянном электрическом напряжении (2b). Кроме того, незначительное начальное изменение, наблюдаемое в образцах с двумя электродами, указывает на общую стабильность ecO2 в течение 14 дней выделения кислорода.
По словам ученых, ecO2 может выделять кислород строго контролируемым образом, не производя вредных побочных продуктов. ecO2 был способен производить кислород в количествах, превышающих атмосферные уровни (21%, 8.238 мг/л при 25 °C) при приложении потенциалов выше 1.6 В. Кроме того, биоэлектронный контроль позволяет точно модулировать напряжение кислорода*, применяя различные потенциалы или изменяя рабочий цикл.
Напряжение газа* в жидкости — сила, с которой молекулы газа стремятся выйти в газовую среду.
Меньшие рабочие циклы обеспечивают дополнительное преимущество в виде продления срока службы устройства за счет снижения энергопотребления и электрохимической нагрузки на каталитические матрицы.
Изображение №3
Далее необходимо было подтвердить селективность выработки кислорода в сложных физиологических условиях. С этой целью ученые отслеживали возможные побочные реакции, такие как окисление хлоридов, образование пероксидов и изменение pH в течение 24-часовой непрерывной генерации кислорода.
Поскольку OER при нейтральном pH приводит к образованию протонов в качестве побочного продукта (2H2O→O2 + 4H+ + 4e-), может произойти локальное изменение pH. Однако pH поддерживался в пределах буферной емкости 1× PBS, которая адекватно имитирует буферную емкость жидкостей организма. При потенциалах выше 1.9 В обнаруживалось выделение перекиси водорода. Несмотря на это, концентрация образующейся перекиси водорода оставалась ниже внутриклеточного уровня 100 нМ вплоть до 2.2 В. Хлор, образующийся при окислении хлоридов (2Cl- → Cl2 + 2e-), не был обнаружен ниже 1.9 В.
Результаты, описанные выше, указывают на широкое рабочее окно для безопасного и селективного выделения кислорода ~ 300 мВ, так как начало OER происходит при 1.6 В, а начало каких-либо вредных реакций начинается только при 1.9 В (3c).
Дополнительная оксигенация необходима для поддержания метаболических потребностей клеток при упаковке с высокой плотностью. Когда существует дисбаланс доступности O2 для поддержания потребностей плотно упакованных клеток, инкапсулированные клетки подвергаются апоптозу*.
Апоптоз* — регулируемый процесс программируемой клеточной гибели, в результате которого клетка распадается на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной.
Чтобы проверить эту гипотезу, ученые поместили клетки ARPE-19 в сферические капсулы (диаметром 415 ± 31 мкм) с плотностью 60 тысяч клеток на мм3 и подвергли культивированию in vitro в течение 21 дня с O2 и без него.
Клетки ARPE-19 были выбраны в качестве модельного образца для исследования из-за их клинической значимости для широкого спектра клеточных терапевтических продуктов для лечения онкологии (NCT05538624), заболеваний глаз (NCT04577300), заболеваний крови (NCT04541628), заменителей ферментов (NCT05665036) и болезни Альцгеймера. Эта клеточная линия широко используется в клинике, поскольку она не канцерогенна, демонстрирует характеристики контактно-ингибированного роста, поддается генетической модификации, а в испытаниях на людях было показано, что она безопасна.
Кластеры клеток высокой плотности, инкапсулированные в альгинатные капсулы, были приняты в качестве модели in vitro для моделирования трансплантации клеток. В каждую каталитическую матрицу добавляли примерно 100 капсул. Среда трансплантации была гипоксическая, то есть лишена кислорода для чистой проверки влияния оксигенации исключительно за счет ecO2.
Оценка live/dead (живые/мертвые) оксигенированных клеток в разные моменты времени с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии показала улучшение жизнеспособности клеток на 83.1 ± 7.5% (3a) после 21-дневной инкубации в условиях гипоксии, в то время как гипоксическая инкубация без оксигенации (отрицательный контроль) показала массивную гибель клеток (жизнеспособность: 8.6 ± 5.6%) (3b). Очевидный контраст на 3D-снимках клеточных капсул подтвердил, что кислород действительно является ограничивающим фактором высокой плотности клеток.
Хотя прогрессивное снижение жизнеспособности клеток в отрицательном контроле было связано с гипоксическим стрессом, только 7.5% живых клеток погибли после 3-недельного культивирования по сравнению с начальной стадией культивирования (89.8 ± 2.8% в день 0) (3c).
Примечательно, что катализаторы SIROF, прошедшие непрерывный 21-дневный 100% рабочий цикл, продемонстрировали нанопористую морфологию с явной деградацией дендритных свойств. Эта деградация также наблюдалась в SIROF, используемом при непрерывной стимуляции нейронных электродов. Интересно, что такая значительная потребность в кислороде в очень плотных клеточных капсулах привела к гипоксической гибели клеток даже при нормальном уровне кислорода (20%, положительный контроль). Это подтверждает, что производство кислорода на месте, превышающее уровень кислорода в атмосфере, имеет решающее значение для решения проблемы дефицита кислорода в плотных или крупных клеточных конструкциях.
Распределение жизнеспособности клеток вдоль оси z показало отсутствие образования гипоксического ядра для капсул с клетками, насыщенных кислородом через ecO2, что представляет собой незначительную разницу между краями и ядром. Эта незначительная разница предполагала, что гибель клеток в этих образцах не была связана с ограничением диффузии кислорода. Напротив, образцы без ecO2 показали явную гибель клеток преимущественно вдали от поверхности. Это свидетельствует о том, что ограничение диффузии вызвало гибель клеток с образованием гипоксического ядра (3d, 3e).
Клетки ARPE-19, использованные в наблюдениях, были созданы для производства и секреции лептина — терапевтического гормона, используемого при ожирении, эндокринных расстройствах и регуляции циркадного ритма. Уровни лептина in vitro определяли количественно с помощью иммуноферментного анализа лептина человека (ELISA) в течение 24-часового периода производства. Концентрация секретируемого лептина из клеток ARPE-19 имела аналогичную тенденцию к жизнеспособности (3f). В то время как количество продуцируемого лептина со временем снижалось в отрицательном контроле, клетки в условиях оксигенации ecO2 демонстрировали стабильные уровни производства и высвобождения лептина в течение 3 недель in vitro при высоких клеточных нагрузках.
Изображение №4
Напряжение кислорода различается в зависимости от тканей, например, 50 мм рт. ст. O2 в почках, 40 мм рт. ст. O2 в поджелудочной железе и 30 мм рт. ст. O2 в общем внутрибрюшинном пространстве. Чтобы проверить эффективность ecO2 in vivo, ученые решили имплантировать платформу подкожно там, где напряжение кислорода ниже (39.0 ± 6.3 мм рт. ст.). Для этого проводилось наблюдение за грызунами после имплантации клеток в течение 10 дней.
В то время как PDMS медицинского класса служил непроницаемым корпусом для электроники, в верхней части клеточного отсека была добавлена микропористая поликарбонатная мембрана, чтобы обеспечить селективный массоперенос питательных веществ, отличных от кислорода. Имплантированный ecO2 состоял из отсека клеточной капсулы, поддерживаемого 8 каталитическими матрицами на 800 альгинатных клеточных капсул (60 тысяч клеток на мм3). ecO2 был имплантирован в брюшной кожный карман и управлялся дистанционно управляемой схемой потенциостата, закрепленной на спине крысы (4a). Устройства были извлечены и проанализированы для оценки жизнеспособности клеток через 10 дней.
На основании визуального осмотра после эксплантации устройств не было обнаружено явных признаков фиброза или скопления жидкости в результате воспаления ни на устройстве, ни в местах имплантации. Капсулы с ecO2 показали значительно более высокую жизнеспособность клеток (73.7%), чем капсулы без ecO2 (26.6%) (4b).
Относительно более низкая жизнеспособность по сравнению с 10-дневной оксигенацией in vitro означает, что объем среды на клетку (in vitro: 2.5 мкл на капсулу, in vivo: 0.27 мкл на капсулу) и обмен средой могут влиять на жизнеспособность клеток. Тем не менее, как показано на 4c, значительное улучшение жизнеспособности насыщенных кислородом клеток подчеркивает эффективность ecO2 для поддержки терапии имплантируемыми клетками.
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.
Эпилог
В рассмотренном нами сегодня труде ученые создали систему, которая может продлить жизнь имплантируемых терапевтических клеток за счет повышения их оксигенации.
Будущее технологий «живых аптек», которые являются имплантируемыми устройствами с клетками, выделяющими нужные вещества, напрямую зависит от плотности этих клеток устройства. Проблема в том, что при высокой плотности клеток потребление кислорода значительно возрастает, а потому необходим метод выработки кислорода прямо в устройстве.
Используя электричество для расщепления воды, в которой находятся клетки, ученые смогли производить кислород, избегая при этом образования вредных побочных продуктов, таких как хлор или перекись водорода. При этом наличие контроля за потребляемой энергией позволял контролировать количество производимого кислорода. Ученые назвали свою разработку ecO2 (от electrocatalytic on-site oxygenator, т. е. электрокаталитический оксигенатор на месте).
Фундаментальным элементом ecO2 является оксид иридия. Внутри устройства клетки уже живут в растворе из воды, солей и питательных веществ. Оксид иридия помогает запустить электрохимическую реакцию при низком напряжении для доставки кислорода, используя уже имеющуюся воду в биожидкостях. Электричество расщепляет воду на водород и кислород.
Во время опытов ecO2 генерировал достаточно кислорода, чтобы поддерживать жизнь плотно упакованных клеток (60 000 клеток на мм3). Использование ecO2 позволял достичь высоких показателей жизнеспособности клеток (около 80%) в условиях практически полной гипоксии, когда кислорода в среде было не более 1%, на протяжении месяца. В контрольной группе, где ecO2 отсутствовал, жизнеспособность клеток падала до 20% уже спустя 10 дней.
В будущем ученые намерены сосредоточиться на долгосрочном внедрении ecO2. В частности, они работают над высокостабильными материалами, которые могут действовать внутри организма на протяжении нескольких месяцев без необходимости замены или какого-либо другого вмешательства. Авторы разработки считают, что их труд позволит создать устройства для клеточной терапии меньшего размера, при этом с большей мощностью и высоким уровнем контроля.
Немного рекламы
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5–2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5–2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4×960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5–2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2×960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5–2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
