Метод RESI позволяет рассматривать объекты в световой микроскоп с ангстремным разрешением
Новый метод RESI позволил достичь ангстремного разрешения с помощью световой микроскопии. Ангстрем = 1/10 нанометра
Главным ограничителем оптической микроскопии долгое время был дифракционный барьер. В силу самой физической природы света объекты на расстоянии менее ~200 нм неразличимы. Можно, конечно, решить вопрос радикально и вместо фотонов воспользоваться пучком электронов. Однако электронная микроскопия требует жесткой пробоподготовки и применима только к неживым образцам. Обойти дифракционный предел позволила флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения — технология, за которую дали Нобелевскую премию по химии в 2014 году.
Сегодня существует множество способов добиться суперразрешения. Один из популярных — локализационная микроскопия одиночных молекул (Single-molecule localization microscopy, SMLM). В ее основе лежит идея контроля концентрации флуорофоров: ученые добиваются того, чтобы в каждый момент времени зажигалась лишь малая толика одиночных излучателей, расположенных на расстоянии больше дифракционного барьера. Дальше — дело техники.
Фиксировать сигнал флуоресценции точечных источников света физики умеют: несмотря на то, что даже один наноразмерный флуорофор будет виден в микроскоп как расплывчатое пятно в 200 нм в диаметре — ведь дифракцию никто не отменял — центр эмиссии и, соответственно, локализацию мишени можно рассчитать математически, аппроксимировав «пятно» гауссовой функцией.
Ученые умеют фиксировать эмиссию одиночных наноразмерных флуорофоров. На рисунке: подгонка функции рассеяния точки (PSF) под Гауссово распределение для определения центра эмиссии и, следовательно, точной локализации флуорофора
Проведя многочисленные последовательные циклы перевода ограниченного числа молекул флуорофора во флуоресцентное состояние, их детекции и фотообесцвечивания, мы получаем много-много изображений. Далее остается сложить их вместе и получить конечную картинку. Таким образом, эмиттеры, которые находятся на субдифракционном расстоянии, в SMLM становятся разрешимыми за счет разделения не в пространстве, а во времени.
Как раз для временного разделения чаще всего используют фотопереключение. Поэтому необходимо, чтобы флуорофоры, которыми метят исследуемый объект, обладали способностью включаться/выключаться под действием освещения. Здесь широко применяют синтетические флуорофоры-красители (метод STORM) или флуоресцентные белки (метод PALM).
DNA-PAINT
Но бывают еще ДНК-зонды: такую технологию называют DNA-PAINT (DNA points accumulation for imaging in nanoscale topography).В этом методе нужны одноцепочечные молекулы ДНК, которые сшиты с антителами к белку-интереса (docking strand) и ДНК-зонды, комплементарные им и меченные флуорофорами (imager strand). Однако никакого фотопереключения в DNA-PAINT не требуется, поскольку флуоресценция запускается только при гибридизация ДНК-цепочек, которая то возникает, то исчезает в буфере сама собой.
Связи между олигонуклеотидами постоянно рвутся, а флуоресценция возникает только при гибридизации ДНК, то есть происходит случайное мерцание без всякого фотопереключения
Исследователи маркируют мишень первым олигонуклеотидом ДНК, сшитым со специфическим антителом. Затем добавляют уже флуоресцентно меченные ДНК-зонды. Наблюдается случайное мерцание редких флуорофоров: ученые только фиксируют изображения, как и в любом другом стохастическом методе. Эта изящная, но довольно времязатратная техника была разработана немецкими учеными из Института биохимии Макса Планка под руководством Ральфа Юнгманна в 2014 году.
Профессор Ralf Jungmann — создатель инновационных методов микроскопии свервысокого разрешения
ДНК-зонды оказались очень удобны для целей мультиплексирования, то есть одновременного изучения сразу нескольких мишеней в образце. Подметод получил имя Exchange-PAINT. По-прежнему достаточен всего один флуорофор:, но теперь он пришивается к разным ДНК-зондам, и белки мишени тоже метятся разными олигонуклеотидами. Сначала добавляются зонды для первой мишени, потом происходит промывка, затем все повторяют для второй.
Принцип мультиплексирования на примере двух мишеней. 2 ДНК-зонда, меченные одним и тем же флуорофором, добавляются последовательно, между ними стадия промывки
RESI
Сегодня группа биофизиков из лаборатории Юнгманна усовершенствовала свой метод, и теперь он обеспечивает точность локализации в 1–2 Å и субнанометровое разрешение с использованием обычного флуоресцентного микроскопа и стандартных реагентов DNA-PAINT! Сотрудники Юнгаманна разработали так называемый метод RESI — улучшение разрешения за счет последовательной визуализации (resolution enhancement by sequential imaging). Статья вышла 24 мая 2023 года в журнале Nature.
Чтобы понять как работает RESI, нужно сделать ремарку: в SMLM-методах, когда получают множество картинок мерцания флуорофоров в разные моменты времени, локализация конкретной флуоресцирующей молекулы определяется неоднократно. В результате эксперимента формируется целое облако точек от одной мишени. А истинное же положение источника эмиссии рассчитывается с помощью статистики и теории вероятности.
Точки на картинке справа представляют собой экспериментально определенные оценки положения одного и того же излучателя в результате неоднократных измерений
Когда же в образце имеется много копий одной молекулы, особенно расположенных очень близко друг к другу, то облака локализаций могут легко перекрываться, что затрудняет их различение. Именно из-за этого максимальная разрешающая способность микроскопии сверхразрешения ограничена 10–15 нм.
Облака локализаций в RESI не перекрываются, благодаря этому достигается «суперсуперразрешение»
Что делает RESI? Он берет лучшее от DNA- и Exchange-PAINT и вводит дополнительную степень дифференциации. С помощью разных ДНК-зондов физики решили мультиплексировать одну мишень, пометив разными олигонуклеотидами соседние копии одной и той же молекулы. И теперь, когда на картинках получают перекрывающиеся облака локализаций, их можно точно группировать, потому что визуализация происходила последовательно. Такая нехитрая идея позволила различить молекулы на расстоянии менее 1 нм.
RESI подобен своему предшественнику Exchange-PAINT, но только используется для 1 мишени
Неограниченное разрешение
Ученые продемонстрировали «крутизну» RESI в трех приложениях.
Ядерная пора
Во-первых, ядерный поровый комплекс (NPC). Это классическая мишень в структурной биологии. Путем маркировки нуклеопоринов Nup96 команда Юнгманна смогли определить расстояние между отдельными субъединицами ядерной поры с непревзойденным разрешением (12 нм), подтвердив данные криоэлектронной микроскопии.
Ядерное (NR) и цитоплазматическое кольца (CR) ядерного порового комлекса, визуализированные RESI
Цепи ДНК
Во-вторых, чтобы продемонстрировать всю мощь RESI, ученые воспользовались ДНК-оригами — техникой направленного конструирования объектов из ДНК. Они смастерили структуру из 6 пар (с интервалом 20 нм) docking strand, расстояние между которыми было всего в ОДНУ пару оснований. RESI смог различить две метки на соседних цепях ДНК с точностью 1,2 Å. Прежде это можно было «делать» только с помощью электронной микроскопии!
а. конструкция ДНК-оригами: красная и синяя цепочки — 2 docking цепи; b. DNA-PAINT дал разрешение в 20 нм, позволив увидеть только 6 структур; c. RESI же смог различить отдельные цепочки ДНК, расстояние между которыми получилось около 8 Å (расчетное теоретически было 7Å)
Антитело и CD
Наконец, специалисты применили RESI для наиболее практически значимых целей: специалисты изучили взаимодействие противоопухолевого моноклонального антитела Ритуксимаб со своим рецептором CD20 в мембране интактных клеток. Клеточные биологи давно пытаются понять, какую форму имеют кластеры CD20: линейную или кольцевую. Группа Юнгманна наблюдала за организацией олигомеров CD20 при связывании с терапевтическими антителами и подтвердила гипотезу о сборке линейных цепочек мембранного рецептора.
RESI позволил различить объекты на расстоянии менее 10 нм, что ранее было не подвластно ни DNA-PAINT, ни криоэлектронной микроскопии в интактных клетках
Хотя в настоящее время метод работает только с неподвижными клеточными структурами и, следовательно, фиксированными клетками, он имеет огромные перспективы. По мнению создателей, RESI должен проложить мостик между флуоресцентной оптической микроскопией сверхразрешения и криоэлектронной микроскопией и другими методами структурной биологии.
К тому же, для исполнения RESI сгодится любой флуоресцентный микроскоп, что делает его доступным практически для всех исследователей уже сейчас!
Для поднятия настроения: молодые и талантливые разработчики RESI
