Как найти сломанную ДНК
В каждом организме постоянно случаются повреждения ДНК. Они могут возникать спонтанно, а могут быть вызваны окислительным стрессом, ультрафиолетовым излучением, радиацией, старением и еще множеством разнообразных факторов. Одних окислительных повреждений у человека в сутки происходит около 10 000.
Большинство неполадок устраняется естественным образом благодаря системе репарации — с помощью специальных белков-ферментов. Они стоят на страже сохранности генетической информации и должны молниеносно реагировать на любые виды повреждений. В противном случае последствия для клеток могут быть тяжелыми: их ждут мутации, гибель, злокачественные перерождения.
Обнаружение повреждений — не простая задача. ДНК состоит из нуклеотидов, которые, в свою очередь, состоят из азотистых оснований, остатка дизоксирибозы и фосфатной группы. Чаще всего поломки происходят в азотистых основаниях. При этом нуклеотидов в ДНК человека — 3,2 миллиарда, а поврежденный участок иногда отличается от неповрежденного лишь несколькими атомами. Как ферменты узнают проблемные участки? Этот вопрос долгие годы изучают в Институте химической и фундаментальной медицины СО РАН (до 2003 года — Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН). Начало работе было положено еще в начале 1990-х благодаря усилиям директора института академика Дмитрия Георгиевича Кнорре. Работа опубликована в Journal of Molecular Biology.
По словам старшего научного сотрудника ИХБФМ СО РАН доктора химических наук Никиты Александровича Кузнецова, накопилось достаточно данных, свидетельствующих о том, что у многих ферментов механизм узнавания и устранения поломок схожий. «Чаще всего необъемные повреждения ДНК устраняются с помощью так называемой эксцизионной репарации оснований (от англ. excision — вырезание. — Прим. ред.), когда фермент буквально вырезает поврежденный нуклеотид. Упрощенно эту систему можно представить в виде четырех этапов, — рассказывает ученый. — Первый этап инициируют ферменты, которые называются ДНК-гликозилазы. Их задача заключается в том, чтобы найти среди множества нормальных оснований поврежденное. Всего у человека 11 ДНК-гликозилаз, и у них есть специализация: разные ферменты узнают разные повреждения».
Александра Федосеева Никита Кузнецов
Из данных рентгеноструктурного анализа известно, что гликозилаза вынуждает ДНК изгибаться. В результате поврежденный нуклеотид выворачивается из нее и попадает в активный центр фермента. Здесь происходит химическая реакция, приводящая к вырезанию поврежденного основания. Затем в процесс включаются другие ферменты, которые ответственны за следующие три этапа репарации: подготовку места разрыва для починки, встраивание правильного нуклеотида и сшивку концов ДНК.
Однако рентгеноструктурный анализ дает представление о статичной структуре комплекса фермента и ДНК. А в лаборатории исследования модификации биополимеров ИХБФМ СО РАН регистрируют процесс взаимодействия фермента и ДНК в режиме реального времени, наблюдая интенсивность свечения флуоресцентных молекул. «В молекуле фермента содержатся остатки триптофана, флуоресцирующие сами по себе. С ДНК сложнее: для того чтобы регистрировать изменения в ней, мы используем синтетические дуплексы олигонуклеотидов, которые помимо поврежденного нуклеотида содержат флуоресцентную группу», — объясняет Никита Кузнецов.
Ученые выяснили, что в процессе узнавания поврежденной ДНК фермент претерпевает конформационные изменения. Можно сказать, он «думает», постепенно изменяя свою структуру, перед тем как образовать комплекс с поврежденным нуклеотидом. «Вначале гликозилаза связывается с ДНК в произвольном месте, а затем начинает поиск поврежденных оснований, перемещаясь вдоль молекулы, как иголка проигрывателя по дорожке пластинки, — говорит исследователь. — У фермента есть несколько аминокислотных остатков, и мы выяснили, что один из них всегда выступает сенсором, сигнализирующим о проблемных участках. В таких местах гликозилаза останавливается, инициирует изгибание ДНК и выворачивание поврежденного нуклеотида. В эту полость встраиваются аминокислотный остаток-сенсор и еще несколько помощников. На каждом из этих шагов происходит специфическое узнавание и верификация, фермент всё больше убеждается, есть повреждение или нет».
Впервые этот механизм сибирские ученые обнаружили у фермента бактерий, носящего название FPG. В новой работе с ним сравнивается схожий по структуре фермент человека NEIL-1, а также еще один бактериальный фермент NEI. Исследователи показали, что, несмотря на разный аминокислотный состав, у всех трех гликозилаз одинаковый механизм конформационной подстройки.
В ИХБФМ СО РАН также сравнили между собой ДНК-гликозилазы, имеющие другую структурную организацию, и у них эти механизмы оказались схожими. Теперь ученые планируют сопоставить разные структурные семейства. «Те механизмы, которые мы увидели, встречаются в зарубежных работах применительно к другим ферментам. Велика вероятность, что множество ДНК-гликозилаз в живой природе работают схожим образом. Думаю, в обозримом будущем это удастся окончательно выяснить и применять полученные знания на практике», — рассказывает Никита Кузнецов.
Понимая процессы узнавания повреждений, можно выяснять, насколько хорошо работают те или иные ферменты у конкретного человека. В ИХБФМ СО РАН в последние годы разрабатывают ДНК-зонды, определяющие активность тех или иных ферментов. Это важно при подборе правильной химиотерапии для лечения онкологических заболеваний. Действие такого лечения направлено на разрушение клеток, и в этом случае нужно подбирать препараты, с которыми система репарации пациента не сможет быстро справиться.
Кроме того, с помощью ДНК-зондов можно оценить устойчивость организма человека, занятого вредной работой, например, на химическом производстве или в условиях повышенной радиации. «Если заглянуть еще дальше, с помощью ДНК-зондов мы, вероятно, сможем обнаружить соединения, которые будут влиять на активность фермента, увеличивая или уменьшая ее, и использовать это для медицинских целей», — делится планами Никита Кузнецов.
Текст: Александра Федосеева
Материал предоставлен порталом «Наука в Сибири»
