Задачи отечественного секвенаторостроения (июнь, 2019 г.)
Перед чтением этого апгрейда желательно ознакомиться с опубликованным ранее исходником.
Самый первый и самый популярный на сегодняшний день нанопоровый секвенатор MinION (минимальный комплект в UK — $1000, в России — 150 тыс. руб.), разработанный компанией Oxford Nanopore Technologies (ONT), работает на одноразовых ячейках, каждая из которых стоит $900 (в России — 135 тыс. руб.). Такие ячейки позволяют за 2…3 дня оцифровать ДНК длиной 10…20 Gb. Этого слишком мало для секвенирования генома человека (нужно >100 Gb), но слишком много для всех прочих клинико-диагностических целей (достаточно <1 Gb).
Недавно стартовали продажи более производительных (и более дорогих) моделей — PromethION 24/48 ($165 000/$285 000), нацеленных преимущественно на поточное полногеномное секвенирование. Дороже стоят и их более производительные расходные ячейки ($2 000/шт., >100 Gb). Правда, оптом они могут стоить дешевле ($1 800 000 за 720 шт., $625/шт.), но для российского бюджета подобные приобретения (200…250 млн. руб. за партию) непозволительны. Да и не только для российского. Поэтому наибольшее внимание посетителей недавней (22–24 мая) конференции компании ONT привлекло сообщение о начале продаж Flongle — адапторной вставки к секвенатору MinION, позволяющей работать с менее производительными (~1 Gb), но сравнительно дешёвыми ($90) одноразовыми ячейками.
https://nanoporetech.com/products
Появление Flongle способно вызвать взрывной рост применения NGS (next generation sequencing) в клинической практике и потеснить обычную ПЦР-диагностику, объём рынка которой в России превышает миллиард рублей, а в мире измеряется миллиардами долларов. Но для большинства российских пациентов NGS-диагностика по-прежнему останется непозволительной роскошью, поскольку стоимость ячеек к Flongle на отечественном рынке будет выше 10 тысяч рублей. А если к ней добавить стоимость расходных реагентов, транспортные издержки и накладные расходы, то расчётная цена секвенирования одной пробы ДНК/РНК не опустится ниже 20 тысяч рублей.
Отсюда следует необходимость разработки отечественных нанопоровых секвенаторов и их обеспечения дешёвыми расходными материалами и реагентами.
Наноридер
Значительно удешевить нанопоровое секвенирование можно при помощи многократного использования ячеек для Flongle и импортозамещения необходимых для работы с ними расходных реагентов. Но для начала нужно обзавестись тестовым устройством, позволяющим наблюдать за формированием бислойных липидных мембран (БЛМ) на 126 лунках рабочей ячейки, и оценивать количество и качество встраиваемых в эти мембраны нанопор. Такое устройство («Наноридер»?) должно отслеживать изменения электропроводности (и/или импеданса) отдельных лунок при формировании на них БЛМ, и регистрировать протекающие через одиночные ионные каналы пикоамперные токи.
Скомпоновать подключаемый к компьютеру по USB 2.0 ридер можно из стандартных элементов: FPGA (100…200$), усилители тока (MAX9923FEUB — 200…300 руб.), АЦП (1…2 тыс. руб.) и т.п… Разработать придётся только плату с нестандартной контактной площадкой (10×13) типа LGA (Land Grid Array) для стыковки с ячейкой от Flongle. Или с её упрощённым отечественным аналогом, содержащим меньшее количество (16…32) сенсорных лунок.
Сенсорная площадка ячейки Flongle
Снижение расчётной производительности ячеек в 4…8 раз (до 10…20 Mb) не критично для решения многих задач (определения патогенов, HLA-типирования, установления отцовства, идентификации личности и т.д.), зато позволяет собрать нанопоровый секвенатор на обычных усилителях пикоамперных токов. И обойтись без применения специальных 512-канальных чипов, в разработку которых оксфордцы вложили десятки миллионов долларов. Правда, каждый многоканальный наноридер должен содержать больше десятка усилителей тока + АЦП, но всё равно он может стоить в несколько раз меньше фирменного сочетания MinION + Flongle (> 200 тыс. руб.). Что касается низкой производительности наноридера, то для российских пользователей, не имеющих приличных компьютеров (медиков, биологов, биохакеров и т.п.), она может оказаться даже полезной.
Килоридер
Разработанные оксфордцами 512-канальные усилители пикоамперных токов содержатся в каждой одноразовой ячейке к MinION. Отработанные ячейки можно выбрасывать, но лучше использовать содержащиеся в них чипы для производства аналогов Flongle, отличающихся повышенной производительностью. Если эти чипы оснастить поверхностными контактами, то они смогут работать с контактными ячейками, содержащими по 2048 (512×4) сенсорных лунок.
Разработать ячейки с такими LGA будет не просто, но нужно учитывать, что требования к контактам здесь менее строгие, чем у процессоров и материнских плат, у которых один плохой контакт способен вывести из строя всю систему. Для секвенатора неработоспособность даже половины контактов ячейки может считаться приемлемой. Оставшейся половины достаточно для обеспечения производительности на уровне 5…10 Gb.
Логичным развитием этой идеи будет объединение в одном приборе нескольких подобных ридеров. Это позволит получить аналог секвенатора GridION X5, рассчитанный на одновременную работу с пятью (и более) многоразовыми ячейками отечественного производства. Такой секвенатор может быть востребован во многих клинико-диагностических лабораториях.
https://store.nanoporetech.com/devices
Одноразовые ячейки секвенаторов PromethION содержат на чипах по 9000 сенсорных лунок. А сами чипы являются 3000-канальными усилителями пикоамперных токов. Поток выдаваемой ими с 24 (у PromethION 24) или с 48 (у PromethION 48) ячеек информации настолько велик, что в «сыром» виде его невозможно передать на обычный внешний компьютер. Поэтому секвенаторы данного типа обязательно комплектуются собственным суперкомпьютером. Но если секвенатор будет работать только с одной ячейкой, то его можно будет подключать и к обычному игровому ноутбуку с портом Thunderbolt 3.0.
Переделка бесплатных (выбрасываемых) чипов от ONT для работы с контактными ячейками не является неразрешимой проблемой. Но построенные на использовании таких чипов секвенаторы смогут работать только с программным обеспечением от ONT. И усилия, которые придётся потратить на переделку этих программ, могут свести на нет преимущества от использования готовых чипов. А разрабатывать подобные чипы с нуля слишком накладно.
Мегаридер
В этом году должно начаться бета-тестирование нанопорового секвенатора компании AXBIO (США). В нём используются чипы с миллионом каналов усиления тока, производимые в Японии израильской компанией Tower Semiconductor Ltd… Расходными реагентами и продажей этих секвенаторов будет заниматься китайский филиал компании AXBIO.
На территории США и Евросоюза нанопоровому секвенированию посвящены больше 7 тысяч патентов, что создаёт непредсказуемые финансовые риски для местных компании, пытающихся заниматься подобными технологиями. По-видимому, это является основной причиной столь высокой интернационализации данной разработки. И позволяет российским компаниям и лабораториям без каких-либо ограничений участвовать в апробации и совершенствовании технологии AXBIO, а также производить (или собирать) такие секвенаторы на своей территории.
Терабайты сырых данных, получаемых нанопоровым секвенатором с мегапиксельными чипами (мегаридером), желательно фильтровать. И передавать на компьютер только самые длинные и качественные риды. Это позволит не только повысить качество секвенирования, но и понизить требования к компьютеру, что тоже немаловажно при массовом производстве и широком применении геномных секвенаторов. Кроме того, избыточная производительность мегаридеров способна уменьшить продолжительность секвенирования генома человека с 2…3 суток (у ONT) до нескольких часов.
Сумма технологий
Успеху компании ONT способствовала организация параллельной конвейерной оптимизации пяти основных элементов технологии нанопорового секвенирования — мембраны, нанопоры, «мотора» (хеликазы), условий секвенирования и алгоритмов расшифровки считываемых сигналов.
https://nanoporetech.com/resource-centre/videos/sub1000
Гарантийный срок хранения ячеек для нанопорового секвенирования зависит в основном от стабильности бислойной липидной мембраны. Сейчас он составляет 6 недель, хотя обычно такие мембраны разрушаются за несколько дней. Для увеличения срока их хранения используют гидрофобные полимерные добавки, поверхностно-активные блок-сополимеры, холестерин, антиоксиданты, поперечную сшивку жирных кислот и т.п., причём подобные модификации могут мешать формированию ионных каналов. Поэтому добиться стабильности БЛМ очень непросто.
Кардинально решить данную проблему позволяет формирование мембран в рабочих ячейках секвенатора и введение в них нанопор непосредственно перед использованием. Самостоятельная подготовка ячеек к работе обеспечит возможность их регенерации и многократного использования. Что касается сроков хранения, то для сухих ячеек он практически неограничен, а необходимые для их активации и регенерации реагенты могут храниться месяцами.
Самое узкое место в технологии нанопопрового секвенирования — это одновременно и самое узкое место нанопоры, от которого зависит качество считываемой информации. Поэтому одной из главных задач компании ONT был поиск мембранного белка, позволяющего получать результаты приемлемого качества.
Первым таким белком стал CsgG — белок наружной мембраны, встречающийся у многих грамотрицательных бактерий. Девять его субъединиц образуют в мембране ионный канал с широкими входным и выходным вестибюлями, и одним узким местом. Но получить достаточно качественные нанопоры (R9, R9.4.1, R9.5.1) удалось только после перебора и анализа сотен модифицированных вариантов CsgG. Этим летом в продаже должны появиться ячейки с порами следующего поколения (R10 или R10b), отличающимися повышенной точностью чтения гомополимерных повторов.
https://nanoporetech.com/about-us/news/london-calling-clive-brown-and-team-plenary
Обязательной составляющей технологии нанопорового секвенирования компании ONT является хеликаза — молекулярный мотор, расплетающий двунитевую ДНК и тормозящий продвижение однонитевой ДНК через нанопору. Максимальная скорость расплетания ДНК таким мотором сейчас достигает 450 пар нуклеотидов в секунду, хотя быстродействие электронных компонентов MinION позволяет повысить её до 1000 нуклеотидов в секунду. Теоретически ускорение работы хеликазы способно удвоить производительность MinION, но на практике это может привести к ухудшению качества секвенирования. Поэтому более быстрые и процессивные хеликазы вряд ли улучшат производительность нанопоровых секвенаторов типа MinION и PromethION.
Качество секвенирования зависит от множества условий — величины подаваемого на мембрану напряжения, электропроводности и ионного состава реакционной смеси, количества и характера закупоривающих поры примесей, возможности очистки закупоренных пор изменением полярности потенциала, структуры используемых адапторов и т.д, и т.п… Поэтому нанопоровое секвенирование требует тщательной оптимизации всех его параметров и составов рабочих растворов (Run Conditions), способных отрицательно повлиять на качество оцифровки нуклеотидных последовательностей. Например, недавно было показано, что уменьшение концентрации расщепляемой хеликазой АТФ постепенно снижает точность результатов секвенирования, и теперь оксфордцы пытаются устранить эту проблему введением в реакционную смесь системы регенерации АТФ.
Пятым элементом технологии нанопорового секвенирования является искусственный интеллект, построенный на рекуррентных нейронных сетях (RNN) и на применении некоторых специальных алгоритмов и программ, улучшающих распознавание гомогенных повторов (Flip-flop, Medaka). В июле должен появиться очередной релиз программ Guppi и MinKNOW, в котором оксфордцы обещают добавить возможность определения метилированных оснований (5mC и 6mA). Это немаловажно не только для эпигеномных исследований, но и для улучшения распознавания обычных оснований.
Большие объёмы считываемой нанопоровыми секвенаторами информации и сложность её обработки предъявляют повышенные требования к аппаратной части таких программно-аппаратных комплексов. Поэтому далеко не каждый компьютер подходит для подключения MinION, в GridION и в PromethION ставятся графические ускорители последнего поколения, а одним из первых покупателей крупной партии модулей Jetson AGX Xavier (NVIDIA), предназначенных для устройств с искусственным интеллектом, стала компания Oxford Nanopore Technologies.
Ещё недавно нанопоровая технология считалась не более чем полезным дополнением к более точным технологиям флуоресцентного и полупроводникового секвенирования. Но постепенное повышение точности чтения ДНК, сочетающееся с большой длиной читаемых последовательностей, позволили ей если не опередить всех конкурентов, то по крайней мере определить главный вектор развития технологий геномного секвенирования.
На освоение всех элементов технологии нанопорового секвенирования может понадобиться довольно много времени, но это не самая большая проблема. Основной проблемой является отсутствие в России целевого финансирования таких комплексных разработок. Правда, в недавно утвержденной Федеральной научно-технической программе развития генетических технологий на 2019–2027 годы (раздел «Направления реализации программы») сказано, что в краткосрочной перспективе (3…6 лет) будет разработан прототип прибора для высокопроизводительного геномного секвенирования. Но найти эту единственную строчку на 30 страницах текста не так-то просто. Проще договориться с китайцами о закупке секвенаторов AXBIO.
Ещё проще — найти умельцев, которые смогут «на коленке» собрать простейший наноридер. И потом ходить с протянутой рукой в поисках инвесторов, которые согласятся профинансировать разработку отечественной технологии нанопорового секвенирования.
