От клеточной культуры — до подопытных людей: тесты наших субстанций07.10.2021 16:32

Логика построения этапов тестирования изначально строилась так: «Человека более жалко, чем животное, а над клеточными культурами вообще можно издеваться как угодно». Поэтому иерархия тестирования выглядит примерно так:

• Математическое моделирование.
• Биохимические и молекулярные исследования.
• Исследования на культурах клеток, биореакторы, DMEM и вот это всё.
• Исследования на мелких грызунах.
• Исследования на нечеловекообразных приматах — ничего опасного и раздражающего.
• Исследования на людях — наиболее безопасные тесты.

Клеточная культура мультипотентных стволовых клеток крысы, окрашивание DAPI. Синим светятся ядра, а стрелки указывают на ядра, которые сейчас активно делятся. Клеткам хорошо, им всё нравится.

Стандарты этичного обращения с лабораторными животными описываются многими декларациями и конвенциями. Одна из наиболее жёстких и требовательных — Directive 2010/63/EU. Отдельные пункты требуют, например, чтобы корм был обязательно вкусным, а не просто питательным, а самим животным не было скучно в пустой клетке. Фактически одна из основных целей подобных конвенций состоит в том, чтобы максимально усложнить содержание животных и в результате заставить отказаться от их использования там, где без них можно обойтись.

Если какой-то тест можно провести на культуре клеток, то использовать для этого грызунов, а тем более приматов, не следует. Мы стараемся придерживаться этих принципов и не используем лабораторных животных для тестов. Нашу продукцию мы сразу начинаем тестировать на людях, обычно начиная со своих же сотрудников.

С точки же зрения науки люди — самый плохой материал. Во-первых, нельзя взять новых и чистых, нужно работать с уже поюзанными, с мутными анамнезами. Во-вторых, они врут, а срез мыши не врёт. В-третьих, они сложны в организации, а мыши всегда под рукой. Но зато люди дешевле, и их допустимо использовать для испытаний средств, которые мы продаём в Европу.

С чего начинается новый крем

Перед тем как начать что-то производить, мы формулируем клиническую задачу, например, хотим помочь людям с себореей, убрать акне и снять воспаление. Заодно неплохо бы замедлить дифференцировку кератиноцитов и снизить продукцию кератина, чтобы средство было эффективно при псориазе.

Дальше мы формируем список нужных компонентов на основании научных исследований и понимания биохимии процессов. В этом случае нам подошёл бы активный ретинол с хорошим трансдермальным транспортом. После этого отдел разработки вместе с отделом закупок ищут нужные компоненты по приемлемой цене.

Например, когда я занималась разработкой средства именно с активным ретинолом, мне нашли липосомальный ретинол по цене «однушки» в Бутове за килограмм. Понятно, что такое средство мы просто не запустим, поэтому ищем дальше вариант за приемлемую цену и уже тогда выпускаем пробную партию.

После этого в дело вступают наши опытные химики-технологи, которые должны убедиться, что все компоненты будут стабильны на протяжении всего срока хранения продукта. При этом они дают экспертную оценку совместимости компонентов. Скажем, одним консервантом мы можем законсервировать средство, содержащее производные никотиновой кислоты, тот же самый ниацинамид. А другим консервантом, например, бронополом, мы этого сделать не можем, так как компоненты будут реагировать с образованием токсичных для человека нитрозаминов.

Или они же, например, заранее знают, что нельзя класть пептидный миорелаксант в одну банку с L-аскорбиновой кислотой и сделать там РН 3.5. Пептид просто гидролизуется ещё в реакторе до расфасовки в упаковку. Поэтому наша сыворотка »5 пептидов», которая содержит много очень дорогих и хрупких пептидных компонентов вроде миорелаксантов аргирелина и леуфасила, тщательно буферизована, чтобы гарантировать стабильную кислотность и сохранность действующих веществ.

Всё это накладывается на сложности при закупке активных составляющих. Мы не крупный международный концерн и не можем закупать сверхдорогие компоненты в 50-килограммовых бочках. А завод просто не отгружает в меньших партиях. Приходится искать тех, кто продаст нам 10 килограммов компонента или даже меньше.

После того как техническая заявка выполнена, а химики добились стабильного состава и нужной консистенции нашего будущего крема, можно переходить к тестам. Они всегда многоступенчатые.

Культуральные тесты

Текущие тренды по защите лабораторных животных требуют проверить всё что только можно на клеточных культурах, а животных лучше вообще пропустить.

Есть несколько ключевых принципов, изложенных у Russel и Burch в работе «Принципы гуманной экспериментальной техники»:

1. Избегайте частого использования животных в экспериментах. Если можете заменить животное на культуру органов, тканей или клеток — заменяйте. По возможности используйте наиболее примитивных с точки зрения нервной системы животных. Условных червяков можно вполне гуманно утилизировать килограммами, а человекообразных приматов вообще разрешено брать только для поведенческих экспериментов.
2. Разрабатывайте стратегию таким образом, чтобы на минимальном количестве животных получить максимум экспериментальных данных. Если на одном образце можно выполнить сразу несколько десятков тестов — не берите вместо этого десять животных.
3. Минимизируйте любые процедуры, которые могут быть дискомфортными или болезненными для животного, если этого можно избежать. Ищите альтернативные протоколы, которые позволят получить данные с минимальными страданиями.

Собственно именно поэтому многие тесты выполняются не на целом животном, а на его клеточных компонентах, которые можно без зазрения совести эксплуатировать и подвергать любым исследованиям. Фибробласты жаловаться и страдать не будут.

Например, в лабораторных условиях мы уже без проблем можем проверять цитотоксичность тех или иных компонентов. Цитотоксичность — это свойство тех или иных веществ негативно влиять на жизнедеятельность и размножение клеток. С помощью подобных тестов как минимум можно оценить оптимальные концентрации исследуемого вещества, которые не мешают клеткам спокойно расти и делиться.

Клетки эукариот гораздо более капризны в выращивании, чем клетки бактерий — прокариот. Просто так взять и размазать по питательному агару фибробласты млекопитающего или другие подобные клеточные линии не получится. Требуется как минимум очень специфичная питательная среда — DMEM: «Модифицированная по способу Дульбекко среда Игла». На ней можно выращивать фибробласты, нейроны, глиальные клетки или что-то специфичное вроде клеточных линий HeLa, 293, Cos-7 и PC-12. Эта среда использует бикарбонатный буфер и для нормальной регуляции pH требует 5–10% CO2 в газовой смеси биореактора. Короче, всё довольно сложно и требует высочайших стандартов стерильности и культивации клеточных культур.

Но все эти сложности хорошо окупаются масштабированием. Вам больше не нужны тысячи мышей и крыс для проведения множества тестов. Можно взять, например, культуру фибробластов и мультипотентных стволовых клеток и сформировать из них клеточный пласт, над которым можно с чистой совестью проводить десятки разных тестов. Животные не страдают, клетки можно окрашивать с использованием биохимических меток на всевозможные маркеры пролиферации, метаболической активности и другие параметры.

Планшет с образцами перед тестированием на цитотоксичность.

Цитотоксичность, например, обычно оценивают с помощью классического MTT-теста. Есть такой специальный реагент с труднозапоминаемым названием в номенклатуре IUPAC: — 3–(4.5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид. Процесс на самом деле довольно прост. Исходный реагент желтоватый и прозрачный. Живые активные клетки своими ферментами превращают его в синий нерастворимый осадок — формазан. Дальше исследователь просто загружает в кучу специальных ячеек образцы, которые росли в присутствии различных концентраций исследуемого вещества. Если клеткам хорошо, то они будут очень бодро создавать синий формазан. Дальше аппарат сравнивает ячейки с контрольным образцом клеток, которые просто росли в чистой среде, оценивает и выдаёт численный результат.

Если фибробласты начинают резко снижать метаболическую активность от нашего вещества, то его, скорее всего, не стоит применять в средствах, которые наносятся на кожу. Если же они, наоборот, начинают активно размножаться и увеличивать свою активность, то это может быть положительным признаком при разработке различных средств для стимуляции регенерации и выработки коллагена. Например, именно так обычно тестируются регуляторные пептиды.

Тесты на животных

Иногда тесты на животных всё-таки проводятся. Но, как правило, это делается только для отдельных компонентов, а не для готового продукта. То есть какой-нибудь консервант могут проверить на канцерогенность у крыс, а вот увлажняющим кремом с этим консервантом бритую крысу уже мазать никто не будет.

На животных поставщики исходных компонентов проводят тесты в нескольких ситуациях:

1. Компонент может вызывать раздражение. Тут мы можем подобрать оптимальную концентрацию, чтобы обеспечить терапевтический эффект, одновременно минимизируя побочное действие.
2. Компонент должен защищать от чего-то, например, от ультрафиолета. Светить ультрафиолетом на культуру клеток довольно бессмысленно, а вот провести тест с солнцезащитным компонентом и кроликом можно.
3. Продукт может иметь последствия для окружающей среды, например, для кораллов или рыбок, если мы говорим о SPF-кремах. На клеточных моделях такое тоже отловить сложно. Приходится строить целые стойки с аквариумами, чтобы проверить воздействие смываемого компонента на морскую фауну. Оно, кстати, есть. Поэтому минимизируйте использование солнцезащитного крема, если ныряете на коралловых рифах. Лучше наденьте защитный костюм — рашгард, а крем нанесите на незакрытые участки тела.

Чтобы соответствовать европейским стандартам, мы все новые компоненты проверяем на то, были ли тесты на животных. Какое-то старое сырьё, конечно, исторически тестировалось, регламент допускает, что до определённого года это было нормальной практикой: историю ретроспективно не поправишь. Опираться на научные исследования, которые когда-то были проведены на животных и были опубликованы, тоже не запрещено.

Тесты компонентов

Мы не проводим тесты на животных. Совсем. Более того, даже те исследования, что мы проводим, — это не классические двойные слепые плацебо-контролируемые варианты, которые приняты при разработке лекарств. У этого есть несколько причин:

• Так дешевле. В итоге весь дополнительный R&D отразится на конечной цене и будет за счёт покупателя.
• Косметика по определению не попадает внутрь и не должна оказывать воздействия на организм в целом. Пожалуйста, не ешьте наши кремы, мы их к этому не готовили. Точнее, мы иногда получаем разрешения на кровоток, но не прописываем их в инструкциях, чтобы не влетать в область фармы. Поэтому «Интенсив-регенерацию» допустимо наносить на открытую рану по исследованию, но категорически нельзя по инструкции.
• Исходные компоненты, которые мы закупаем, уже прошли все исследования на токсичность и биосовместимость.
• Если мы испытаем что-то из косметики на животных, то не сможем продавать это в Европе, а это большой рынок для нас. Кроме этого, в РФ в принципе нет требований тестировать готовый продукт на животных.

Фактически мы получаем уже готовые сертифицированные компоненты, которые были изолированно протестированы. После этого мы можем смешать из них любую стабильную композицию, которая будет решать поставленную при разработке задачу. Поэтому, если у каждого исходного компонента есть паспорт безопасности, нет смысла заново тестировать на безопасность готовый продукт. Это уже было сделано поставщиками.

К каждому компоненту идёт MSDS — паспорт безопасности химической продукции. Именно этими данными мы руководствуемся при создании новых продуктов. Если на консерванте заявлено, что в состав можно добавить не более 0,1%, значит, именно такую концентрацию производитель установил как безопасную. Дозу превышать нельзя, так как можно получить раздражение или токсический эффект.

Помимо формальных бумаг и сертификатов, мы непосредственно проверяем каждую партию исходных веществ. У хороших поставщиков сырьё всегда имеет стабильное качество и строго соответствует тому, что написано в документации. А ещё бывают не очень добросовестные продавцы из азиатских регионов, у которых мы никогда ничего не покупаем. Такие нехорошие люди получают сертификат один раз, а потом проводят творческое переосмысление продукта в каждой партии. В первый раз придёт канистра с мутно-белым содержимым, потом — с оранжеватым, а в третьей партии жидкость начнёт мерзко пахнуть чем-то посторонним. По моему опыту, в большинстве дешёвых средств по уходу за кожей — именно такие нестабильные полуподвальные компоненты.

Тесты на устойчивость

Микробиология

Чтобы получить хороший крем или сыворотку для кожи, его обязательно нужно проверить в различных сценариях использования. До того как начинать мазать новым составом добровольцев, надо для начала убедиться, что продукт не расслаивается сам по себе и в принципе сохраняет свои свойства в течение всего срока хранения.

Начинаем мы обычно с физико-химической и микробиологической устойчивости. Почти любой продукт — это желанная пища для микроорганизмов. Нам нужно убедиться, что там не смогут выжить условная кишечная палочка или, например, плесневые грибы. Консерванты нужны именно для этого. Если их не добавлять, то условный крем будет храниться не дольше, чем порция какого-нибудь тирамису в холодильнике.

Требования к микробиологической устойчивости очень сильно зависят от упаковки. Лучший вариант — это унидозы, когда в герметичной упаковке лежит крем ровно на одно применение. Этот вариант мало подходит для ежедневного применения, поэтому в быту самый «чистый» вариант — это вакуумные флаконы. Содержимое при этом почти не контактирует с внешней средой, и контаминация минимальна. Самый сложный вариант с точки зрения бактериальной чистоты — это баночки с большой крышкой. Обычно подразумевается, что вы используете пластиковую ложечку из комплекта, а после каждого использования её моете. В реальности её почти всегда теряют в первую неделю, а потом макают грязные пальцы прямо в крем. Именно поэтому крем в такой форме по определению будет содержать больше консервантов.

Термостабильность

Есть одно очень важное эмпирическое правило, которое сформулировал Вант-Гофф: «При повышении температуры на каждые 10 градусов константа скорости гомогенной элементарной реакции увеличивается в два–четыре раза». Более корректно это описывается уравнением Аррениуса, но для нас важно, что мы можем провести тест на ускоренное старение продукта в термошкафу. Три месяца инкубации при 40 градусах Цельсия будут эквивалентны году хранения где-то на полочке у пользователя. Иногда состав настолько нежный, что нагревать его нельзя. Тогда мы открываем несколько баночек, кладём в шкаф и ждём весь заявленный срок хранения при комнатной температуре.

Мы изначально проектируем состав таким образом, чтобы в нём не оказалось несовместимых компонентов. Например, не будем класть быстро окисляющийся ингредиент с окислителем в один флакон. Наоборот, ему положен какой-нибудь антиоксидант в компанию, чтобы он дольше не окислялся. После тестов на ускоренное старение мы проводим анализ состава продукта, чтобы убедиться, что заявленное количество активного вещества «дожило» до окончания срока хранения. После теста мы можем немного поправить доли компонентов в исходном составе, чтобы они дольше хранились.

А ещё мы обязательно тестируем экстремальные случаи. Например, что произойдёт с партией крема, если его по дороге на Сахалин заморозят где-то в грузовике? Можно ли его потом разморозить и использовать или надо сразу выбрасывать? Мы всегда стараемся проектировать состав таким образом, чтобы подобные случаи не влияли на качество. Цвет, запах, текстура и консистенция должны сохраняться после разморозки. Всё это нужно для того, чтобы человек мог спокойно купить флакон сыворотки где-то в Сибири, положить в пакет и пойти домой, когда на улице минус 20. Или положить этот пакет в багажник летом в Краснодаре и довезти целым.

Любые сильные перепады температуры сокращают срок хранения и могут вызвать деградацию структуры, поэтому лучше всего хранить нежные сыворотки и кремы в тёмном сухом месте при комнатной температуре. В холодильник кладём только в том случае, если это отдельно указано на упаковке, иначе постоянные перепады температуры и конденсат могут плохо сказаться на сроке хранения. В ванной их оставлять не надо, чтобы кто-то из членов семьи потом не почистил зубы вашим кремом. Температура с влажностью там тоже не очень. Зато там прекрасно могут жить нетребовательные гели для умывания и тоники.

Тесты на людях

До финального тестирования доходят заведомо безопасные компоненты, которые уже были проверены по отдельности производителями, а затем нами уже в виде композиции. Стабильность была проверена, и мы уверены, что крем не развалится, если на него случайно посветит солнце. А если даже посветит и он развалится, то на упаковке будет крупное предупреждение, что содержимое нужно хранить в тёмном месте.

Задача проверки продуктов на человеке — определение оптимальных пропорций компонентов и их концентрации. В серьёзных научных исследованиях обычно используют очень дорогие методики. Например, у живого человека берут биопсию участка кожи, на который наносился состав, содержащий низкомолекулярную гиалуроновую кислоту. Затем биоптат изучают в том числе под электронным микроскопом для того, чтобы оценить глубину проникновения.

Мы таких тестов обычно не проводим, так как у нас просто нет электронного микроскопа на производстве. Если действительно нужно что-то сложное, то мы заказываем исследование у сторонней лаборатории, которая имеет всё необходимое. У нас задача обычно более практическая, например, нам нужно убедиться, что средство не раздражает кожу, если это не задумано изначально, как с ретинолом. Он раздражает, но это нормально.

Ничего фатальнее местного раздражения, зуда или комедонов при тестировании обычно не бывает. Чаще всего даже эти побочные эффекты отсутствуют. Тестирование идёт в два этапа: альфа- и бета-тесты.

Сроки таких исследований никем не регламентированы. Мы сами решаем, когда продукт получился хорошо и готов к производству. Например, «Brightening skin» мы тестировали четыре года, пока не вышли на ту формулу, которая стала реально уменьшать поверхностную пигментацию за две-три недели, а не за полгода. Плюс мы сами переделали всю исследовательскую часть, когда внезапно пропал поставщик основного компонента — койевой кислоты — и нам пришлось искать другого.

Альфа-тест

Кого включаем в группу

В первую группу попадают люди с соответствующей патологией, если средство лечебно-профилактическое. Обычно это 15–30 человек. Если мы тестируем средство, в котором есть сосудоукрепляющие компоненты, то выберем человека с куперозом и склонностью к покраснениям. Если мы тестируем матирующее средство, то возьмём людей с жирной кожей.

Тесты могут быть самими различными и составляются каждый раз индивидуально. Например, как долго кожа будет оставаться матовой? Будут ли побочные эффекты в виде сухости кожи, шелушения или раздражения? Как поведёт себя средство, если попасть под дождь или под палящее солнце? Заодно мы сразу тестируем всю органолептику. Вне зависимости от цели у продукта должна быть приятная текстура, а не консистенция противной слизи со странными комочками.

Тестируем запахи

Продукт должен обязательно приятно или нейтрально пахнуть. Запах — это вообще очень важная история, так как многие исходные компоненты могут иметь слабый, но не очень приятный аромат. Отдушка должна сглаживать эти недостатки и нравиться большинству испытуемых. Если средство прекрасно работает, но 25% людей говорят, что запах не нравится, то мы меняем отдушку. Меньше всего хочется потом увидеть в отзывах, что наше средство нормально работает, но чем-то воняет. Сейчас мы столкнулись с новой проблемой: появилось много людей, у которых после перенесённого ковида привычные вещи стали неприятно пахнуть. Мы даже думаем попробовать включать в тестовую группу нескольких людей с такими нарушениями обоняния, чтобы подобрать аромат, который будет приятен всем. А если в формуле можно обойтись совсем без отдушки — мы обходимся без неё, так средство будет максимально гипоаллергенным.

Тесты на аллергические реакции

Обязательно проверяем переносимость. Если средство будет вызывать контактный дерматит у значимого процента испытуемых, то мы будем искать аллерген и переделывать всю пробную партию.

Сложности фотоотчётов

Чтобы тесты были более объективными, мы всё документируем. Каждый испытуемый проходит полное обследование. Если этого требует протокол исследования, то испытуемого не просто фотографируют без фильтров и коррекции, но и делают снимки специальным микроскопом — дерматоскопом. Например, при исследовании средств против пигментации мы фиксируем оттенок кожи, тон пигментных пятен. Затем сравниваем результат после курса нового средства. Аналогично документируем сосудистые звёздочки, если средство предполагает положительный эффект на микроциркуляцию и капилляры кожи. Глубину морщин мы тоже измеряем и вносим в протокол исследования.

Ключевая проблема тут в фотоотчёте. Я думаю, что все из вас видели «красивые» фотографии для Инстаграма и потом «обычные» в повседневной жизни. Девушки очень стараются, тщательно выбирают позу, выражение лица, угол освещения, а потом накидывают сверху кучу цифровых фильтров для полной гарантии. В итоге получается довольно красивый результат, но совершенно далёкий от реальности.

Люди привыкли, что обычно все фотографии, связанные с индустрией красоты, сильно отретушированы. Чаще всего все пары «до» и «после» процедуры снимаются за одну фотосессию, а потом допиливаются в Photoshop«е. Именно поэтому, чтобы в процессе тестирования не было возможности намеренно или случайно исказить результаты, мы разработали подробный стандарт того, как нужно правильно фотографировать пациента. Это всегда несколько стандартных выражений лица, одинаковые свет, фокусное расстояние объектива, расстояние от камеры до лица пациента и много других параметров.

В результате не только мы, но и испытуемые могут оценить прогресс. Например, пациенты с розацеа смотрят на коллаж из своих снимков в разные дни и видят изменения сосудистого рисунка. При необходимости эти данные используются для коррекции протоколов и рекомендаций по применению.

Бета-тест

В бета-тесте мы расширяем группы. Это уже не узкая группа испытуемых, которые лечат определённую патологию у дерматолога косметолога, а обычные люди в привычной среде обитания. Тестирование проводим в естественных условиях.

Например, защитное SPF-средство мы раздавали группе сёрферов, которые отправлялись на Маврикий, и альпинистам, которые совершали восхождение на Эльбрус. В альфа-тестировании мы вначале проверили уровень SPF по специальным лабораторным справочникам, а потом — в специальной лаборатории, аккредитованной для проведения тестов на людях, при помощи облучения участков кожи ультрафиолетом.

Обычно на этапе бета-теста мы окончательно корректируем ароматизаторы и вносим изменения в упаковку, если это необходимо.

Почему мы тестируем, хотя это необязательно

Вся эта история с тестированием своих продуктов — это про то, как мы сами себе придумали сложности, пока конкуренты выпускают новые линейки каждые три месяца. Это при том, что этого времени с трудом хватает просто на оформление бумаг. Реальные требования к косметическим продуктам очень минималистичны: не ядовитое, есть сертификаты на исходные компоненты — значит, можно запускать.

Мы же хотим убедиться и сами для себя выработали очень жёсткий многоступенчатый протокол, чтобы быть уверенными не только в эффективности и безопасности средства, но и мелких вещах вроде удобства крышки или дозатора, когда используешь его жирными руками.

Иногда в процессе исследования выявляются не только нежелательные, но и положительные побочные эффекты. Так получилось, например, с «Альфадермом», который изначально был рассчитан как средство для пациентов со склонностью к жирности и комбинированной кожей. Одной из испытуемых была девушка, которая, скорее всего, когда-то обморозила кончик носа, и это нарушило иннервацию капилляров. У неё всегда был купероз, и она всё время ходила с красным кончиком носа. После курса «Альфадерма» у неё внезапно исчезла сосудистая проблема с носом. До этого 12 лет ходила, а теперь всё прошло. Почему именно так произошло, мы сказать не можем, но, вероятно, это эффект от миндальной кислоты, которая позитивно влияет на стенки сосудов. Так как этот эффект был зафиксирован на фото во время исследования, мы расширили показания к применению и стали давать средство тем, у кого есть склонность к покраснениям, например, при эритематозной стадии розацеа. В итоге отметили значимое клиническое улучшение у этой группы, хотя ничего прям прицельно-сосудистого в компонентах не задумывалось изначально.

Ну и, конечно, самые нестандартные варианты расширения показаний придумывают сами пациенты. Кто ж будет читать эту инструкцию, когда можно просто взять и куда-нибудь намазать? Так случилось с «Сeramide skinsaver», который женщины в климактерическом периоде совершенно внезапно начали использовать на коже и слизистых половых губ. В период возрастного угнетения функции яичников пациентки страдают от сухости и раздражения в области половых органов. И вот тут почему-то взлетел продукт, который тоже никто не планировал наносить подобным образом. Мы задокументировали, изучили и, возможно, официально расширим показания к применению. Сейчас это, конечно, офф-лейбл-применение, которое мы в инструкции не заявляем, так как не исследовали.

Если интересно, как мы создаём новые средства, то заходите к нам в telegram-канал (@geltek_cosmetics). Там мы рассказываем интересные штуки про хроники нашей уютной лаборатории.

© Habrahabr.ru