«Мышиная возня» в инфракрасном свете: внедрение наночастиц в субретинальную область глаза мыши08.03.2019 13:04

Окружающий нас мир полон информации в самых разных формах ее проявления. Не имеет значения где вы находитесь: в помещении или на улице, в городе или среди поля, в тропиках или в заснеженной тундре. Всегда и везде ваш мозг получает какую-то информацию. Сам по себе этот орган, если утрировано, бесполезен в вопросе информирования вас об окружающей среде. В помощь ему у нас есть органы чувств (глаза, уши, язык, нос и кожа). Однако далеко не всю информацию мы способны воспринимать, в частности инфракрасное излучение, которое не видимо нашим глазам. По крайней мере так было раньше. Сегодня мы с вами познакомимся с исследованием, в котором обыкновенную мышь наделили способностью видеть инфракрасное излучение ближней области посредством нанотехнологий. Как ученые достигли этого, как чувствовала себя мышь после «усовершенствования» и какие перспективы сего открытия для человека? На эти и другие вопросы мы будем искать ответы в докладе исследовательской группы. Поехали.

Основа исследования

Зрение у человека не самое лучшее, но и не самое худшее, среди жителей планеты Земля. Правильнее будет сказать, что оно имеет определенные ограничения. Мы способны воспринимать «видимый свет», то есть излучение в диапазоне от 400 до 700 нм. Но вот инфракрасное излучение ближней области (далее NIR) находится выше верхней границы в 700 нм.

Если же копнуть чуть глубже, то проблема заключается в строении глаза млекопитающих, то есть и нас с вами. В глазу имеются фоторецепторы — светочувствительные сенсорные нейроны сетчатки глаза. Внутри клеток имеются опсин* и родопсин*, которые играют одну из важнейших ролей в восприятии света, то есть в зрении.

Опсины* — рецепторы, связанные с G-белками, расположенные в фоточувствительных клетках сетчатки.

Родопсин* — белок, основной зрительный пигмент, содержащийся в палочках сетчатки глаза.

Весь этот коллектив рецепторов направлен на улавливание света, то есть фотонов. Но с NIR излучением все гораздо сложнее. В случае NIR фотоны обладают более низкой энергией. Следовательно, опсины должны обладать более низким энергетическим барьером, чтобы такие фотоны воспринять. В противном случае имеется только сильный тепловой шум. Другими словами фоторецепторы млекопитающих просто-напросто физически не способны «улавливать» световое излучение выше 700 нм, в частности NIR излучение.

Но мы-то с вами знаем, что истинных ученых не могут остановить какие-то физиологические ограничения. Решить проблему с фоторецепторами можно предоставив им помощников в виде наночастиц, которые будут выполнять те функции, что недоступны естественным клеткам (органам, системам и т.д.). Это и сделали ученые в своем исследовании. Они разработали специальные наночастицы со встроенным автономным источником светового излучения, которые могут расширить диапазон зрительного спектра млекопитающего (в данном случае мышей). Ученые поясняют, что наночастицы pbUCNP (retinal photoreceptorbinding upconversion nanoparticles) это своего рода преобразователи энергии. Они преобразовывают инфракрасное излучение ближней области в более коротковолновое видимое излучение.

«Модификация» глаз мыши производилась путем субретинальной инъекции (под сетчатку) наночастиц, разбавленных в натрий-фосфатном буфере. Использование электроретинографии* и данных зрительных вызванных потенциалов* из зрительной коры мозга мыши помогло установить факт того, что сетчатка и зрительная кора были достаточно активны при воздействии внешнего раздражителя в виде инфракрасного излучения. Проще говоря, мышь с внедренными наночастицами pbUCNP реагировала на NIR излучение.

Вызванный потенциал* — электрическая реакция органов на внешний раздражитель.

Электроретинография* — изучение состояния сетчатки глаза посредством регистрации биопотенциалов, возникающих при световом раздражении.

Также были проведены поведенческие тесты, которые также подтвердили вышеуказанное утверждение. Помимо этого ученые провели проверку биосовместимости наночастиц и организма мыши, которая показала лишь незначительные побочные эффекты. О результатах испытаний, тестов и анализа данных мы поговорим чуть позже, а пока нам стоит ознакомиться с тем, из чего же состоят эти удивительные наночастицы.

Структура pbUCNP

Основной задачей наночастиц являлась конвертация инфракрасного света (более 700 нм) в видимый. Учитывая, что глаз человека наиболее чувствителен к видимому свету с длиной волны в 550 нм, были созданы так называемые преобразовательные (или ап-конверсионные) наночастицы UCNP (1A и 1B).

Если говорить о фотонах, то ап-конверсия это процесс конвертации нескольких фотонов с более низкой энергией, то есть с большой длиной волны, в один фотон с более высокой энергией, т.е. с короткой длиной волны. А именно это и нужно, учитывая свойства фоторецепторов глаза млекопитающих.

Изображение №1

Эти наночастицы демонстрировали пик спектра возбуждения в 980 нм и пик излучения в 535 нм при световом воздействии в 980 нм (1C и 1D).

Чтобы получить водорастворимые наночастицы, ученые применили белок конканавалин А (ConA) к поверхности частиц paaUCNP, то есть покрытых полиакриловой кислотой (1E). Использование ConA обосновывается тем, что данный белок отлично связывается с остатками сахара и производными внешнего сегмента фоторецептора, в результате чего образуются гликозидные связи*.

Гликозидная связь* — ковалентная связь между молекулой сахара и другой молекулой.

Необходимо было проверить успешность внедрения ConA на поверхности UCNP. Для этого ученые добавили в раствор с pbUCNP b-циклодекстрин, который обладает такой же глюкозильной единицей, как и внешний сегмент фоторецептора. В результате этого произошла агрегация (объединение) ConAb-циклодекстрина (снимок ПЭМ на изображении 1G).

Следовательно, подобные наблюдения подтверждают, что pbUCNP смогут успешно присоединиться к поверхности фоторецепторов мыши.

На ПЭМ снимке 1H видно, что pbUCNP сохраняют свою монодисперсность при добавлении b-циклодекстрина, а все потому, что в данной комбинации отсутствует белок ConA. Введение таких pbUCNP в субретинальную область глаза мыши (1F) привело к тому, что наночастицы связывались друг с другом, образуя тесную связь и с внутренними и c внешними участками колбочек и палочек (1J, 1K и 1L). Таким образом формировался слой наночастиц с характерным ап-конверсионным спектром (снимок слева на 1I).

Если же в субретинальную область глаза мыши были введены paaUCNP частицы, то они образовывали очень непрочные связи, потому их можно было легко удалить с фоторецепторов (снимок справа на 1I).

Проверка биосовместимости не показала каких-либо серьезных отклонений. Для проверки в субретинальную область глаза мыши также вводили простой раствор натрий-фосфатного буфера (без наночастиц) — разницы обнаружено не было. Те побочные эффекты, которые были обнаружены, были связаны с самой субретинальной инъекцией и полностью исчезли в течение 2 недель после процедуры.

Проверка целостности сетчатки и здорового количества фоторецепторов показала, что даже при введении 50 мг pbUCNP в каждый глаз отрицательных изменений не наблюдается. То есть, структура слоев сетчатки не деградирует (это видно на изображениях 2А и 2В).

Изображение №2

Также ученые решили проверить наличие воспалительных процессов в сетчатке глаза крысы, использовав маркер микроглии Iba1. Анализ показал незначительное воспаление сетчатки на 1-ой, 2-ой, 4-ой и 10-ой неделе после инъекции pbUCNP (2С и 2Е).

Помимо этого был проверен апоптоз (распад) клеток сетчатки после инъекции посредством маркировки терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL). Сигналы TUNEL были обнаружены только спустя 3 дня после инъекции как pbUCNP, так и чистого натрий-фосфатного буфера (2D). На 1-ой, 2-ой, 4-ой и 10-ой неделе после инъекции признаки TUNEL не были обнаружены (2Е).

Суммируя результаты вышеописанных анализов, ученые пришли к очевидному выводу — pbUCNP не несет вреда организму испытуемого (мыши), кроме определенных побочных эффектов, вызванных исключительно самой процедурой укола в субретинальную область глаза.

Теперь, когда мы знаем что такое pbUCNP и как он влияет на здоровье подопытных мышей, можно перейти к рассмотрению результатов практических испытаний работоспособности наночастиц pbUCNP.

Результаты исследования

Изображение №3

Для проверки реакции фоторецепторов на инфракрасное излучение были взяты образцы палочек из сетчатки глаз у мыши с инъекцией наночастиц и у мыши без нее (3А).

Палочки мышей, которым была сделана инъекция pbUCNP, показали нормальный фототок, вызванный видимым светом в 535 нм, в отличие от мышей без инъекции (без инъекции — 3В и с инъекцией — 3D).

При воздействии световой вспышки в 980 нм была получена ответная реакция только от палочек мышей с pbUCNP (3Е), палочки обычных мышей никак не отреагировали (3С). Также стоит отметить сильное сходство амплитуды и кинетики фототока в палочках мышей с pbUCNP при воздействии света 535 нм и 980 нм (3F, 3G и 3H). А соотношение времени и пиков говорит о том, что задержки активации палочек при воздействии инфракрасного излучения не было. Также было выявлено, что палочки (после инъекции) быстро адаптируются к инфракрасному свету, как это обычно происходит с видимым светом.

Электроретинограмма (ERG) мышей с и без инъекции также подтвердила факт реакции на инфракрасное излучение в 980 нм. При этом результаты ERG мышей с pbUCNP сильно напоминали результаты при воздействии светового излучения видимого диапазона (535 нм). У контрольной группы мышей (без наночастиц) реакций не было.

Кроме этого ученые провели тест с мышами, у которых не было палочек. Эта проверка показала активацию колбочек излучением в 980 нм посредством воздействия на них наночастиц pbUCNP.

После проведения лабораторных тестов ученые перешли к проверке на практике, так сказать. То есть, они решили воочию понаблюдать за поведением мышей с и без инъекции в специальных условия.

Изображение №4

Для практического эксперимента использовались две коробки: темная и освещенная посредством излучения в видимом и инфракрасном диапазоне (4С и 4D). Второй вариант эксперимента основан на взаимосвязи светового раздражителя и вызванного им чувства страха (4E и 4F). А теперь детальнее о каждом из экспериментов.

В первом тесте с темной и освещенной видимым светом коробкой мыши, естественно, предпочитали находиться в темной. Видимый свет был заменен на светодиодный с длиной волны 980 нм. В таком варианте мыши с инъекцией наночастиц продолжали выбирать темную коробку, а не освещенную, следуя своим врожденным инстинктам, так сказать. А вот контрольная группы мышей (без инъекции) не видела никакой разницы между двумя коробками (темной и со светом 980 нм), так как они буквально не воспринимали инфракрасное излучение.

Второй эксперимент был связан с изучением еще более обдуманных действий мышей. На этапе подготовки мыши из обеих групп обучались тому, что вслед за 20-секундным излучением светом 535 нм (видимым) последует двухсекундный незначительный удар током (4Е). В ответ на такой раздражитель должна последовать вполне естественная ответная реакция у мышей — оцепенение*.

Реакция оцепенения* — у некоторых видов животных, которые как правило являются добычей, существует защитный механизм (так сказать, последний шанс). В случае если хищник уже напал на них, они могут «притвориться мертвыми» (оцепенеть), тем самым сбить атакующего с толку и, уловив подходящий момент, сбежать.

Как мыши реагируют в случае опасности (оцепенеть, спрятаться или агрессивно тряски хвостом).

Во время этапа фактического тестирования применялось световое излучение как в 535 нм, так и 980 нм. В результате мыши с инъекцией pbUCNP проявляли реакцию оцепенения при обоих типах светового воздействия, так как ожидали удара током. А вот мыши без наночастиц никак не реагировали на инфракрасное излучение. А это говорит о том, что они не воспринимали его во время подготовки и, следовательно, не смогли связать невидимое для них излучение с ударом тока. У контрольной группы мышей была ответная реакция только на свет в видимом диапазоне. На изображении 4F показано сравнение результатов данного теста у контрольной группы мышей и у мышей с инъекцией.

Данные практические тесты подтвердили факт того, что мыши с pbUCNP воспринимают инфракрасное излучение, но могут ли они реально видеть в таком диапазоне, в прямом смысле этого слова? Дабы получить ответ на этот вопрос ученые провели еще один тест — измерение VEP, т.е. зрительных вызванных потенциалов (5А). Для этого в шести областях зрительной коры мозга мыши были установлены электроды (№ 1, 2, 3 и 5 — в монокулярных областях и №6 — бинокулярных областях).

Изображение №5

Когда на глаза воздействовал видимый свет (535 нм), наблюдалась реакция во всех областях зрительной коры у всех мышей (с и без наночастиц), что вполне ожидаемо (5B и 5D). А вот при свете в 980 нм мыши разделились на две группы, как и в предыдущих тестах. У мышей с инъекцией были обнаружены VEP в бинокулярных областях зрительной коры мозга (5C и 5E). У контрольной группы никаких VEP выявлено не было. Стоит отметить, что проявление VEP именно в бинокулярных областях согласуется с местом проведения инъекции (височная сторона).

На этом «мышиная возня» не закончилась. Следующей проверкой опять стал более практический тест с водным лабиринтом в форме буквы «Y» (6А), по которому мыши с pbUCNP должны были ориентироваться по инфракрасному излучению.

Изображение №6

Во время подготовки мышей обучали находить спрятанную платформу, которая была связана с одним из двух маршрутов по лабиринту. Всего учеными было сделано 5 вариантов теста с разными визуальными стимулами и световым излучением.

В первом варианте были световые решетки (6В), положение полос на которых указывал направление движения. Мыши с наночастицами успешно обучились различать ориентации полос (вертикальную или горизонтальную) и отлично их видели при воздействии светового излучения в 980 нм. Контрольная группы выбирала платформы в случайном порядке, то есть не могла отличить их друг от друга ввиду невозможности видеть в инфракрасном спектре (6С). В тесте где использовался видимый свет (как и во время обучения) обе группы мышей успешно справились с задачей.

Измерение волнового числа (пространственной частоты) показало, что у мышей с инъекцией этот равен 0.31 ± 0.04 при видимом свете. У мышей из контрольной группы этот показатель равен 0.35 ± 0.02, то есть особых отличий между обеими группами испытуемых нет. Следовательно, введение наночастиц в сетчатку не повлияло на то, как мыши воспринимают видимый свет. В случае инфракрасного излучения у мышей с pbUCNP вышеуказанный показатель был 0.14 ± 0.06. Такое снижение пространственной частоты ученные связывают с изотропным излучением и рассеянием видимого света от возбужденных инфракрасным светом наночастиц (6D).

Во втором варианте теста ученые решили проверить мешает ли восприятию инфракрасного излучения фотонов излучение в видимом диапазоне. Было сделано 2 пластины со светодиодными матрицами видимого (535 нм) и инфракрасного (980 нм) излучения, которые расположены перпендикулярно друг к другу. Когда все светодиоды были выключены, обе пластины выглядели идентично на фоне видимого света (6Е).

Во время подготовки в тестовой камере было включено освещение (видимый свет, 196 лк) и только 980 нм светодиоды. Во время фактического теста только мыши с инъекцией смогли успешно распознать пластины (6F). Это говорит о том, что их восприятие инфракрасного излучения никак не ухудшилось из-за фонового излучения видимого света. В случае, когда были включены только 535 нм светодиоды, обе группы мышей показали хорошие результаты, как и ожидалось.

Следующий тест заключался в распознавании треугольников и кругов (6G). Мыши с pbUCNP успешно различали фигуры в видимом и инфракрасном свете, когда тестовая камера была неосвещенной, то есть в темноте (6H). Контрольная группа могла обнаружить только фигуры из видимого света.

После этого в задачу была добавлена еще одна переменная — фоновый свет, но не видимый, как раньше, а инфракрасный. Мыши с pbUCNP все так же успешно отличали фигуры инфракрасного/видимого света при фоновом инфракрасном излучении.

В заключительном тесте ученые решили выяснить, могут ли мыши с инъекцией видеть фигуры в инфракрасном и видимом диапазоне одновременно. В данном тесте был водный лабиринт с платформами, на которых изображался одновременно круг и треугольник. Во время подготовки активными были только треугольники в видимом свете. А вот во время тестирования были и треугольники и круги (980 нм) в случайной последовательности (6I). Как и ожидалось, мыши с pbUCNP прекрасно отличали фигуры (6J). Проверка результатов данного теста у обеих групп испытуемых мышей подтвердила, что мыши с инъекцией делали выбор той или иной платформы не случайно, в отличие от контрольной группы. Таким образом, можно слетать вывод, что инъекция pbUCNP позволяет мышам видеть объекты как в инфракрасном, так и в видимом диапазоне одновременно.

Для более детального ознакомления с нюансами исследования настоятельно рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.

Эпилог

Подобное исследование является отличным доказательством того, что нанотехнологии могут быть применены в очень разных направлениях. Конечно, говорить о том, что их возможности безграничны пока еще очень рано, но с каждым днем мы получаем все больше и больше новым путей применения нанотехнологий. В данном конкретном случае использование наночастиц для того, чтобы одарить мышей инфракрасным зрением является не только занятным экспериментом, но и подтверждением уникальных возможностей внедренных улучшений в биологические системы. Сами ученые пока не готовы делать громких заявлений касательно применения их разработки в медицине или в каких-либо других областях, однако они будут продолжать свои исследования с целью усовершенствовать вышеописанные наночастицы и, возможно, наделить их новыми свойствами.

Как бы то ни было, широкое применение аугментаций человеком для совершенствования и изменения своего тела произойдет еще нескоро ввиду не только несовершенства технологий, но и множества этических вопросов, которыми уже задаются многие общественные деятели. Можно ли разрешать человеку изменять свое тело? Где граница допустимых аугментаций? Как это повлияет на социально-классовое расслоение в обществе? Породит ли это новые конфликты в и без того конфликтом мире? Список подобных вопросов можно продолжать, но четких ответов на них пока никто не дал (игры серии Deus Ex не в счет). Возможно принцип «время покажет» подходит сюда как нельзя лучше.

Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас оформив заказ или порекомендовав знакомым, 30% скидка для пользователей Хабра на уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5–2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps от $20 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).

VPS (KVM) E5–2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps до лета бесплатно при оплате на срок от полугода, заказать можно тут.

Dell R730xd в 2 раза дешевле? Только у нас 2 х Intel Dodeca-Core Xeon E5–2650v4 128GB DDR4 6×480GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $249 в Нидерландах и США! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5–2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?

© Habrahabr.ru