Генетически кодируемые флуоресцентные сенсоры
В чем состоят преимущества и недостатки технологии генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров? В каких случаях биологи используют флуоресцентные сенсоры? Что такое FRET? На эти и другие вопросы отвечает доктор биологических наук Константин Лукьянов.
Прежде чем говорить о генетически кодируемых флуоресцентных сенсорах, стоит несколько слов сказать о флуоресцентных белках, на основе которых они построены. Флуоресцентные белки представляют собой уникальный тип белковых молекул, которые самостоятельно могут формировать флюорофор внутри себя за счет модификаций собственных аминокислотных остатков. Для этого им не надо ни дополнительной ферментативной активности, ни кофакторов, за исключением молекулярного кислорода, который обычно все-таки присутствует в биологических моделях. Это свойство позволяет использовать флуоресцентные белки в качестве генетически кодируемых флуоресцентных меток. Вам необходимо внести один-единственный ген флуоресцентного белка в модельный организм, чтобы получить на выходе видимую флуоресценцию. Вы можете прикрепить флуоресцентный белок, поскольку он белок, к другим белкам, просто закодировав его в одну рамку считывания с этими белками. Вы можете направить его в разные компартменты клетки с помощью специальных сигналов, которые направляют клеточные белки в данные компартменты, и делать множество других трюков, позволяющих изучать клетку изнутри, не добавляя к клеткам ничего извне — ничего химически синтезированного и, как правило, ядовитого.
Флуоресцентные белки позволяют видеть структуры клетки и белки, которые находятся в клетке, — как они расположены в клетке, какую динамику они имеют. Но, кроме этого, хотелось бы видеть функциональные активности: активности ферментов, активности ключевых регуляторных каскадов, изменения концентрации ионов, которые, как правило, ведут к изменениям регуляторных каскадов, изменения мембранного потенциала в нейронах и другие события.
Чтобы сделать флуоресцентный сигнал флуоресцентного белка чувствительным к чему-то, существует несколько разных подходов. Самый простой из них — сделать флуоресцентный белок чувствительным к тому, что мы хотим измерить. К сожалению, этот подход очень ограничен, флуоресцентные белки крайне нечувствительны ни к чему, и можно сделать их чувствительными только к изменениям pH, кислотности в клетке. Но тем не менее это очень важный показатель, стабилизация pH в клетках очень важна, во многих случаях она изменяется направленно, и это ведет к различным биологическим эффектам. Поэтому на основе флуоресцентных белков действительно было получено довольно много хорошо работающих сенсоров на pH, где изменение кислотности среды напрямую воздействует на флуоресцентные свойства флуоресцентного белка — просто потому, что в его хромофоре есть ионизуемая группа, которая может протонироваться или депротонироваться. Но это уникальный случай, во всех остальных случаях флуоресцентный белок не может чувствовать ту активность, которая вам интересна.
Что же делать? В данном случае надо создавать химеры флуоресцентных белков с чувствительными доменами, то есть с белковыми доменами, взятыми из живой природы, которые, собственно, и сделаны природой для того, чтобы чувствовать какие-то изменения среды, сигнальные события, ионы и все прочее. Хорошо то, что для любого биологически значимого события можно найти такие домены.
Потому что, если событие биологически значимое, клетка должна его чувствовать, и, значит, в ней есть какой-то белковый рецептор к этому событию.
Если такового рецептора нет, то, значит, это событие биологически незначимое и сенсоры для него не нужны.
Можно соединить флуоресцентный белок с чувствительными доменами и сделать так, чтобы изменения конформации чувствительных доменов в ответ на изменение среды привели к изменениям флуоресцентных свойств. Как это сделать? Самый простой и, наверное, широко распространенный способ — использовать резонансный перенос энергии между двумя флуоресцентными белками — это так называемый FRET, (fluorescence resonance energy transfer), фёрстеровский, или флуоресцентный, резонансный перенос энергии. Когда рядом оказываются два флюорофора, в том числе два флуоресцентных белка, один из которых немножко синее, а другой немножко краснее, и они расположены очень близко друг от друга в нанометровом диапазоне, то наблюдается нерезонансный перенос энергии с более коротковолнового флюорофора на более длинноволновый. И этот эффект можно очень широко использовать. Например, если вы возьмете два флуоресцентных белка, а между ними поместите чувствительные домены, то изменение конформации этих чувствительных доменов приведет к изменению взаимной ориентации или расстояния между флуоресцентными белками, что приведет к изменению FRET, и вы можете увидеть это с помощью микроскопии. Изменение яркости или цвета флуоресценции белка позволяет в реальном времени отследить изменения в составе внутриклеточной среды: изменения мембранного потенциала, ионной среды, pH или активности регуляторных ферментов.
В чем ограничения генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров? Прежде всего, в том, что их нельзя использовать в моделях, где вы не можете допустить генетическую модификацию клеток — например, для человека. Никто из нас не хочет делаться генно-модифицированным, чтобы в нас экспрессировался зеленый флуоресцентный сенсор, даже если нам очень интересно, что происходит в составе организма. Поэтому это применимо только для биологических моделей. Но в остальном генетически кодируемые сенсоры намного превосходят химические или физические сенсоры, которых тоже существует большое количество.
Почему превосходят? Дело в том, что вы можете добиться чрезвычайно высокой чувствительности, чрезвычайно высокой специфичности ответа за счет использования природных доменов, которые обычно очень чувствительны и очень высокоспецифичны к тому событию, которое вы хотите мерить. Как правило, никакие химические красители не могут достичь той же специфичности и селективности. Второе — вы можете направить флуоресцентный сенсор в любую часть клетки. Поскольку это белковая молекула, вы можете присоединить любые сигналы локализации этого сенсора, направить его ядро в цитоплазму, митохондрии, любые органеллы и даже маленькие субкомпартменты. Это очень важно, потому что как глупо измерять температуру по больнице, так же и в клетке очень важно то место, где вы измеряете тот или иной сигнал. Клетка с точки зрения биохимии представляет собой огромный комплекс, четко разделенный на разные компартменты и разделы, и в каждом из них происходят совершенно разные реакции, важно мерить именно в этом месте. Опять же, как правило, химические сенсоры и тем более какие-то физические чипы и электроды нельзя поместить в столь небольшие прецизионные компартменты клетки.
Кроме того, в составе целого организма можно направить флуоресцентный сенсор именно в нужный тип клеток, чтобы не весь организм его экспрессировал, а только определенный тип нейронов или других клеток, что позволяет мерить активность только четко выделенной популяции.
И, наконец, последнее преимущество — это отсутствие экзогенно (снаружи) добавленных веществ, которые в ряде случаев просто трудно добавить и донести до нужных тканей, а в ряде случаев они могут быть токсичны и неприятны; кроме того, они обычно довольно дорогие.
Как у всякой технологии, у технологии флуоресцентных сенсоров есть большие перспективы развития. Существует большое количество очень интересных и важных процессов и в клетке, и в организме, для которых до сих пор не сделано генетически кодируемых флуоресцентных сенсоров. Стоит отметить, например, оксид азота, NO, который играет очень важную регуляторную роль в организме, но до сих пор хорошего флуоресцентного сенсора на него не сделано. Или, например, кислород — очень трудно оценивать уровень кислорода в тканях и клетках без генетически кодируемого сенсора, а его нет. Кроме того, даже существующие сенсоры надо улучшать.
Вообще опубликовано огромное количество флуоресцентных сенсоров, работающих исключительно в лабораториях, которые их разработали.
Например, за счет того, что специфический ответ можно увидеть только в определенных условиях, потому что он составляет 5%, а иногда и 1% от сигнала. И в каких-то очень хороших модельных условиях это видно, но на практике все это поглощается шумами. И практике нужны яркие, высококонтрастные, то есть с высоким динамическим диапазоном, чтобы флуоресценция изменялась во много раз, сенсоры. Опять же в красной и дальней красной областях спектра сенсоров на сегодняшний день почти нет.
В последние годы появились новые типы флуоресцентных белков, они основаны на белковых доменах, которые связывают кофакторы, уже имеющиеся в клетках. Таким образом, они не могут формировать их сами, но они, по сути, являются генетически кодируемыми — вам необходимо только принести один ген данного белка, а кофактор уже имеется в клетке. Эти белки также открывают новые перспективы развития сенсоров. Например, один из типов новых флуоресцентных белков обладает дальней красной и даже инфракрасной флуоресценцией, которая недостижима для старых флуоресцентных белков.
Полный текст статьи читайте на Postnauka.ru
