Гидрогель и табак: синтез живых материалов
Для создания чего-либо нужны соответствующие материалы, обладающие необходимыми химическими и физическими свойствами. Если же есть необходимость наделить материал свойствами, которыми он не мог обладать в своем первичном виде, необходимо заставить его структуру меняться в ответ на определенные стимулы. В синтетической биологии ученые пытаются внедрять живые клетки в материалы, заставляющие их расти. В большинстве таких исследований применяются бактериальные или грибковые клетки. Однако мало кто уделяет внимание клеткам растительного происхождения, ведь полученные с их помощью материалы обладают очень простой структурой и крайне ограниченным функционалом. Несмотря на эти недостатки, у растительных клеток есть большой потенциал. Ученые из Американского химического общества (Вашингтон, США) провели исследование, в ходе которого им удалось создать биочернило для 3D-принтера, в которое внедрены генетически модифицированные клетки растений, позволяющие программировать полученный материал. Какие именно клетки использовали ученые, какими свойствами обладали полученные материалы, и где может быть применена данная технология? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.
Основа исследования
Сконструированные живые материалы являются результатом совместной работы биологии и инженерии. Данная область науки нацелена на сопряжение живых клеток и неживых матриц для производства материалов с определенными функциями. В отличие от обычных материалов, искусственные живые материалы могут расти, самовосстанавливаться, адаптироваться к изменениям окружающей среды и реагировать на те или иные стимулы. Объединив черты живых организмов со стабильностью и долговечностью неживых веществ, сконструированные живые материалы становятся источником огромного потенциала для широкого спектра применений.
В биоинженерии с применением живых клеток, обычно используются бактерии или грибы, так как они обладают быстрым ростом и возможностью создания тонких биопленок. Если же в этот процесс добавить возможности современной 3D-печати, то потенциал таких технологий возрастает в разы.
Недавние достижения в области суспензионных культур растений вызвали энтузиазм по поводу их использования в создании искусственных живых материалов, учитывая их быстрый рост и потенциал для создания фабрик растительных клеток. Присущая им структурная жесткость, обусловленная богатыми целлюлозой клеточными стенками, в сочетании со способностью осуществлять фотосинтез создает основу для автономной и энергоэффективной системы. Кроме того, уникальный вторичный метаболизм и способность подвергаться генетическим манипуляциям делают растения идеальной платформой для производства множества полезных вторичных метаболитов и фармацевтических белков. Эти преимущества в сочетании с их способностью реагировать на стимулы окружающей среды и биоразлагаемостью делают искусственный живой материал на основе растений привлекательным вариантом для расширения спектра биоинженерных материалов.
В рассматриваемом нами сегодня исследовании ученые создали новый класс инженерных живых растительных материалов (EPLM от engineered plant living material), которым можно придать необходимую геометрию и функциональность посредством роста и трансфекции* растительных клеток в индивидуальных гранулированных гидрогелевых каркасах.
Трансфекция* — процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки эукариот невирусным методом.
Клеточная линия Nicotiana tabacum (табак обыкновенный) Bright Yellow-2 (BY-2) использовалась в качестве модельной системы в этом исследовании для демонстрации создания целлосодержащих гидрогелей в EPLM с использованием технологий 3D-биопечати. Для обеспечения жизнеспособности растительных клеток и биопринтинга ученые разработали и приготовили биосовместимые гранулированные гидрогелевые микрочастицы (HMP от hydrogel microparticle) с четко выраженными реологическими свойствами.
Результаты исследования
Изображение №1
Первым этапом исследования стало производство гранулированных гидрогелевых каркасов для биопечати растительных живых материалов (PLM от plant living material). Биочернила BY-2, которые использовались для печати PLM, состояли из трех компонентов:
- HMP в плотноупакованном состоянии как дискретная фаза, составляющая основу биочернил;
- клетки табака BY-2, которые являются одной из наиболее широко используемых растительных суспензионных клеточных линий, полученных из N. tabacum, и могут поддерживаться в жидких культурах;
- предшественники гидрогеля Gel-MA, внедренные в пустотное пространство в виде непрерывной фазы, образуя полимерную сетку между HMP и клетками BY-2 (схема выше).
Благодаря своим свойствам утончения при сдвиге и самовосстановлению зажатые HMP и предшественники гидрогелей уникально подходят для применения в биочернилах, обеспечивая стабильную экструзию нитей как при экструзионной печати, так и при суспензионной биопечати.
Изображение №2
На 2A показан процесс изготовления PLM, который включает в себя заклинивание и отверждение HMP с последующим выращиванием клеток BY-2 внутри каркасов из гранулированного гидрогеля. Gel-MA HMP были созданы с использованием микрофлюидного устройства с процессом фотосшивки. Сгенерированные HMP были одинаковыми по размеру, их диаметр постоянно колебался от 110 до 140 мкм. Снимки HMP, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM от scanning electron microscopy), выявили их пористую структуру. Впоследствии образовавшиеся HMP переносили из масла в раствор Gel-MA и затем смешивали с клетками BY-2. Затем смесь подвергли «застреванию» путем удаления водной среды из частиц и клеток, создав экструдируемые чернила с компонентами микрогеля и клетками BY-2, отчетливо видимыми под микроскопом.
Реологическое исследование биочернила BY-2 было проведено для оценки их пригодности для прямого письма чернилами*.
Прямое письмо чернилами* (DIW от Direct Ink Writing) — это процесс 3D-печати, при котором вязкие чернила в качестве сырья выдавливаются из шприца под пневматическим давлением.
Биочернила демонстрировали разжижение при сдвиге, при этом вязкость уменьшалась с увеличением скорости сдвига (2B). Кроме того, биочернила BY-2 претерпели быстрый и обратимый переход из твердоподобного упругого состояния в жидкоподобное вязкое состояние при воздействии высокой (2C). Такое поведение, вероятно, вызванное нарушением контактов между HMP при более высоких напряжениях деформации, продемонстрировало способность биочернил BY-2 эффективно течь во время экструзии и быстро стабилизироваться после осаждения, отражая типичные свойства суспензий микрогелей. Кроме того, фотореология синим светом при отверждении (405 нм) показала, что G' увеличилась с 4.37 ± 0.35 до 546.83 ± 131.33 Па, демонстрируя, что биочернила могут превращаться из физических гелей в химически сшитый каркас под действием световое облучение.
Трехосный экструзионный принтер, оснащенный прецизионным коническим соплом (внутренний диаметр 770 мкм), был использован для демонстрации двух методов биопечати PLM, включая послойную биопечать на поверхности и технику суспензии в поддерживающей ванне.
В методе послойной биопечати нить диаметром около 750 мкм печаталась на криогенной поверхности, создавая рисунок «снежинки», а затем подвергалась фотосшивке для повышения структурной стабильности (2D).
Чтобы оптимизировать соотношение BY-2 и HMP для роста PLM, сначала готовилась смесь раствора BY-2 и Gel-MA путем смешивания 0.22 ± 0.01 г клеток BY-2, отобранных из твердой культуральной среды, с 500 мкл Gel-MA (10 мас.%). Затем смесь смешивали с разными объемами HMP (2E). Наибольший прирост биомассы был получен при добавлении HMP в раствор BY-2 и Gel-MA в соотношении 2:1, а именно от 1.19 ± 0.07 г (1-й день) до 2.25 ± 0.05 г (14-й день). По мере инкубации PLM клетки BY-2 пролиферировали внутри гранулированного гидрогелевого каркаса, в результате чего PLM становились заметно плотнее, о чем свидетельствует желтая окраска (2D). Кроме того, рост растительных клеток был однородным по всему материалу. Напечатанные PLM неизменно сохраняли свою структурную целостность и механическую жесткость на протяжении всего периода роста. Другие геометрически сложные конструкции также можно было напечатать путем послойного осаждения.
Биочернила BY-2 были дополнительно введены в поддерживающие ванны, разжижающиеся при сдвиге, посредством процесса гель-в-геле для суспензионной печати (2F). Пролиферацию клеток внутри микрогелей определяли по видимому росту и по весовой маркировке, которая показала 6.25-кратное увеличение биомассы через 7 дней (2G).
Изображение №3
Учитывая устойчивый рост клеток BY-2 в каркасах из гранулированного гидрогеля, ученые изучили возможность интеграции сконструированных клеточных линий BY-2 для введения новых функциональных возможностей и изготовления EPLM. Бактерии вида Agrobacterium tumefaciens часто используется для доставки представляющих интерес генов (GOI от genes-of-interest) в широкий спектр видов растений, включая клеточную линию табака BY-2. Чтобы разработать эффективную стратегию доставки чужеродной ДНК в клетки BY-2 внутри EPLM, ученые воспользовались успехом HMP для создания инъекционных микропористых каркасов, которые, значительно повышают эффективность трансфекции инфильтрированных клеток. С этой целью культуры Agrobacterium были трансформированы GOI посредством электропорации, внедрены в HMP как Agro-HMP, а затем смешаны с клетками BY-2 и Gel-MA в биочернила (3A).
Встроенные клетки Agrobacterium были способны локализоваться и размножаться в HMP через 24 часа, что было подтверждено анализами окрашивания живой/мертвый (3B). Примечательно, что скорость роста клеток Agrobacterium, встроенных в растворенные в LB HMP в жидкой среде LB или MS, была аналогична скорости роста клеток, свободно выращенных в среде LB, и значительно выше, чем у клеток, свободно выращенных в среде MS (3C). Agro-HMP, несущие гены, кодирующие GFP, смешивали с клетками BY-2, и через 48 часов после инкубации можно было наблюдать зеленую флуоресценцию клеток BY-2.
Было показано, что длительный период заражения отрицательно влияет на рост BY-2. Поэтому была выбрана инкубация в течение 48 часов, после чего была применена среда MS, содержащая 25 мкг/мл ампициллина, для промывки трансформированных каркасов и уничтожения клеток Agrobacterium внутри Agro-HMP, минимизации биообрастания и предотвращения выщелачивания Agrobacterium из HMP. Интенсивность флуоресценции GFP от EPLM постоянно увеличивалась в течение недели после трансформации (3D).
Ученые отмечают, что эта стратегия трансформации Agrobacterium, опосредованная HMP, имеет несколько преимуществ по сравнению с традиционными методами простого смешивания культур Agrobacterium и BY-2:
- клетки Agrobacterium были заключены в HMP, поэтому можно было достичь пространственно контролируемой трансформации клеток BY-2;
- внедренные клетки Agrobacterium было легко уничтожить после завершения трансформации, чтобы избежать заражения;
- совместимость с рабочим процессом 3D-печати;
- трансформированные EPLM были готовы к использованию сразу после промывки.
Пространственно контролируемая печать и трансформация EPLM являются важными шагами на пути к созданию многофункциональных EPLM со сложной морфологией. С этой целью Agro-HMP, несущие гены, кодирующие GFP, сначала были загружены в специальную камеру для 3D-культуры клеток. Впоследствии клетки BY-2 были распределены по всей площади камеры (3E) или специально напечатаны в центральном слое (3F), создавая флуоресцентные узоры в зависимости от распределения сконструированных клеток BY-2. Пространственно-направленной трансформации клеток BY-2 способствовало контролируемое осаждение Agro-HMP в определенных областях камеры для культивирования клеток, что демонстрирует умение системы создавать EPLM со сложной пространственной конфигурацией.
Изображение №4
Интеграция EPLM, отличающихся настраиваемыми трехмерными формами и пространственно контролируемой трансфекцией, с быстрорастущими инструментами синтетической биологии создает множество новых возможностей, таких как исследования in vitro межклеточных коммуникаций в искусственной среде и разработка технологий биопроизводства для синтеза вторичных метаболитов.
Беталаны представляют собой класс красно-фиолетовых или желтых пигментов, обнаруженных в Caryophyllales (порядок цветковых растений гвоздичноцветные). Эти пигменты обладают высокой коммерческой ценностью в качестве натуральных красителей и пищевых добавок. Путь биосинтеза беталаинов начинается с общего субстрата, L-тирозина, и производит видимые пигменты всего за 2 или 3 этапа (4A). Учитывая простоту такого синтеза и ценность его результирующих продуктов, ученые решили использовать беталаны в качестве модели для оценки эффективности EPLM.
Гены, кодирующие ферменты биосинтеза беталаина, были клонированы в три конструкции, а именно:
- BET-Y (Betalain-Yellow, содержащий BvCYP76AD6 и BvDODA) для продукции желтых пигментов бетаксантинов;
- BET-R-1 (Betalain-Red-1, содержащий BvCYP76AD1 и BvDODA);
- BET-R-2 (содержащий MjcDOPA5GT), которые в сочетании продуцируют красный пигмент бетанин (BET-R-1 и BET-R-2 в сочетании продуцируют красный пигмент бетанин; 4А).
В экспериментах BET-R-1 было недостаточно для того, чтобы вызвать сильную красную пигментацию, поэтому во всех последующих опытах для производства бетанина использовалась смесь культур Agrobacterium, несущих BET-R-1 и BET-R-2, названная BET-R.
Было показано, что при инфильтрации, опосредованной Agrobacterium, BET-R и BET-Y эффективно индуцируют образование красной и желтой пигментации, соответствующей бетанину и бетаксантину, в листьях N. Benthamiana. Затем были изготовлены Agro-HMP, несущие BET-R и BET-Y. Далее они были экструзионно напечатаны вместе с клетками BY-2 в структуры с сетчатым рисунком. Сгенерированные EPLM были способны расти в течение 24 дней без загрязнения и отображали соответствующий красный или ярко-желтый цвет для трансформированных с помощью BET-R или BET-Y Agro-HMP соответственно (4B, 4C). Экстракты BY-2 из EPLM BET-R и BET-Y демонстрировали пики поглощения при 535 и 485 нм, что соответствует зарегистрированным длинам волн поглощения для бетанина и бетаксантина, что также было подтверждено методом LC-MS (4D).
Изображение №5
Структурные и функциональные конфигурации EPLM легко адаптировались с помощью 3D-печати, что позволяло одновременно применять различные биочернила для создания EPLM с множеством функций. Ученые продемонстрировали эту возможность, напечатав листовидную структуру с использованием двух биочернил, содержащих Agro-HMP, несущих BET-R и BET-Y (5A). Биочернила BET-R и BET-Y использовались для печати жилок и мезофилла* листовидного каркаса соответственно.
Мезофилл* — внутренняя хлорофиллоносная ткань, выполняющая основную функцию — фотосинтез.
Клетки BY-2 внутри каркаса показали значительный рост в течение 14 дней культивирования (5B), а химерные узоры, состоящие из красной жилки и ярко-желтых частей мезофилла искусственного листовидного каркаса, можно было наблюдать через 24 дня (5C). Накопление пигментов внутри клеток BY-2 привело к образованию клеток красно-фиолетового или желтого цвета соответственно (5D).
Ученые отмечают, что трансформируемые свойства каркасов позволяют клеткам внутри каркасов осуществлять желаемую трансгенную экспрессию. Таким образом, конкретные функции и свойства искусственных листьев можно настроить путем генетического перепрограммирования различных клеток каркаса во время производства искусственных листьев. Это потенциально важно для прогресса в области функциональных живых материалов и биопроизводства сложных ценных химикатов.
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.
Эпилог
В рассмотренном нами сегодня труде ученые, объединив биологию и инженерию, создали новый класс инженерных живых растительных материалов (EPLM от engineered plant living material). Используя клетки BY-2 Nicotiana tabacum (табака обыкновенного) в сочетании с биосовместимыми гранулированными гидрогелевыми микрочастицами (HMP от hydrogel microparticle), это исследование демонстрирует большой потенциал технологий 3D-биопечати в создании биосовместимых, структурно разнообразных и функционально динамических EPLM.
Превосходство использования зажатых HMP объясняется их улучшенными возможностями печати, способностью создавать структурно и механически точные каркасы, а также потенциалом улучшения жизнеспособности и функционирования клеток в материалах, созданных на базе биологических компонентов.
Также во время опытов было показано, что трансформация агробактерий, опосредованная HMP, не только облегчает рост растительных клеток в каркасах, напечатанных на 3D-принтере, но также позволяет вводить чужеродную ДНК. Это приводит к образованию вторичных метаболитов и различных паттернов пигментации.
В будущем ученые намерены продолжить свое исследование с целью совершенствования разработанного ими материала. Тем не менее полученные в ходе исследования результаты говорят о том, что подобного рода разработки приближают нас к созданию самодостаточных и настраиваемых живых материалов с широким спектром применений, от устойчивого строительства до фармацевтики.
Немного рекламы
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5–2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5–2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4×960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5–2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2×960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5–2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
