Нейровизуализация и коннектомика29.10.2015 13:07

Молекулярный биолог Джефф Лихтман о зеленых флуоресцентных белках, брейнбоу и попытках получить полную карту мозга

Нейронаука как дисциплина зародилась с окрашивания по методу Гольджи, который ученый разработал на собственной кухне. Метод позволил выделить отдельную группу клеток и увидеть ее во всей красе. Возможность увидеть группу так отчетливо появилась потому, что этим методом помечалось только очень небольшое подмножество клеток, которые были случайным образом распределены среди тех, что не были окрашены. В конце XIX века это стало революцией, изменившей наше представление об устройстве мозга.

Однако этого было недостаточно, метод ограничен. Поэтому на протяжении многих лет люди пытались придумать способы получения более полной информации. Можно вводить красители в клетки — опять же вы увидите лишь небольшую их часть. Можно окрасить ткань, чтобы найти молекулярные маркеры, которые отмечают клетки определенного типа. Но если вас интересуют нервные цепи, вам необходимо видеть каждую клетку, которая в них входит, — каждую как отдельный объект, самостоятельную сущность, отличную от всех остальных. Множество клеток, которые отделены друг от друга, на молекулярном уровне при этом не так уже различны.

Думая над методами, которые позволили бы нам увидеть каждую клетку как самостоятельную сущность, мы воспользовались революцией в исследованиях флуоресцентных белков. Зеленый флуоресцентный белок, известный как GFP, — удивительное открытие, авторы которого удостоились Нобелевской премии по химии в 2008 году. Открытие GFP дает возможность сделать «вставку» в геном животного, благодаря чему тот начнет производить белок. При наведении света определенной длины волны мы получим ответ флуоресцентным свечением, немного смещенным в сторону более длинных волн. Это ключевой момент в понимании флуоресценции: например, вы светите тем, что известно как «черный свет», то есть ультрафиолетовым излучением, невидимым человеческому глазу, однако способным активировать пигменты, которые затем станут светиться ярко-красным или ярко-зеленым. Флуоресценция работает именно так.

Итак, мы направляем на зеленый флуоресцентный белок синий свет, и он в ответ испускает зеленый. Вскоре после того, как эти белки были открыты, органические химики начали понимать, как работает флуоресценция, и осознали, что путем мутации гена, кодирующего GFP, можно получить его красную и желтую версии, которые бы излучали различные цвета. Несколько групп в России, например, выяснили, что существует целый ряд морских организмов, которые, как кораллы, имеют флуоресцентные пигменты, очень похожие на зеленый флуоресцентный белок, но других цветов. Эти гены тоже можно ввести животным.

Так что теперь у нас есть большая палитра красок для введения в организмы, но этих цветов все равно недостаточно, чтобы придать каждой клетке мозга свой оттенок. Цветов просто не хватает, но вот интересный факт: мы, люди, воспринимаем все видимые для нас цвета, имея только три вида фоторецепторов в наших глазах. Мы чувствительны лишь к красному, зеленому и синему, и именно их сочетание, соотношение красного, зеленого и синего сигналов, приходящих из каждой маленькой части зрительного поля, придает каждой вещи собственный уникальный цвет. Мы подумали: хорошо, а что, если мы внесем случайное количество красного, зеленого и синего флуоресцентного белка в каждую клетку, чтобы та приобрела свой цвет радужного спектра, и нам удастся увидеть сразу много разных клеток?

Именно это мы и сделали. Жан Ливей, который был постдоком, когда начинал работать в этом направлении (а теперь у него есть своя лаборатория в Париже), Джош Сейнс, мой коллега, и я с помощью еще нескольких талантливых молодых людей разработали инструмент, который позволит мышам производить множество цветов в каждой нервной клетке. Это форма рекомбинации: вы делаете генетическую вставку и случайным образом заставляете группу цветов, которая может быть экспрессирована, в самом деле экспрессироваться, в результате чего у каждой клетки будет немного отличный от остальных цветовой спектр. Этот подход называется брейнбоу.

Следующим шагом было создание вирусов, которые можно ввести любому животному, тем самым «заразить» его мозг цветами, чтобы окрасить каждую клетку в свой оттенок. Это хороший инструмент для наблюдений, в особенности периферической нервной системы, например, моторных нейронов, идущих к мышечным волокнам, в которых не так много других элементов. Это здорово: вы можете прослеживать связи очень большой длины и отметить практически всё на схеме.

Но если вы будете использовать методы типа брейнбоу в центральной нервной системе, выделяя всё, вы тут же будете обескуражены огромным количеством присутствующих там компонентов. Плотность так велика, что световой микроскоп часто не в состоянии распознать связи, даже если они разных цветов. Так что мы пытались придумать другие методы преодоления этих технических трудностей. Например, вместо того чтобы наблюдать мозг во всем объеме, можно делать очень тонкие срезы, и для нас «очень тонкие» — это около 30 нанометров. Нанометр очень-очень маленький — это 10 ангстрем, это как 10 атомов водорода. 30 нанометров — это одна тысячная толщины человеческого волоса. Вот какой толщины наши мозговые срезы. Они очень тонкие, и, чтобы их делать, мы создали (автоматический) аппарат. Кен Хейворт и Ричард Шалек построили прибор, который делает срезы нужной толщины, а затем кладет их на конвейер из пленки, так что в конечном итоге мы получаем длинную ленту, где каждый участок мозга лежит на 30 нанометров от предыдущего участка этой гигантской ленты. Вы как бы берете мозг и «разбираете» его на фрагменты, как куски киноленты. Мы рассматриваем мозг кадр за кадром. Но если проиграть наш фильм, это будет движение не во времени, а в пространстве: мы начинаем в передней части мозга и продвигаемся вглубь, и таким образом можно отследить каждую связь, малейшую область.

Нейроны, помеченные комбинацией флуоресцентных цветов (flickr / Maia Valenzuela)

Мы используем этот метод главным образом с электронной микроскопией — так можно проследить практически каждую связь. Мы называем это глубокой коннектомической реконструкцией. Мы остаемся в рамках коннектомики, но отмечаем каждую связь и каждое соединение и получаем огромное количество информации — около двух тысяч терабайт с кубического миллиметра. Это большой объем данных, у нас постоянно заканчивается место для хранения, а анализ сам по себе огромная проблема. Но мы неплохо продвинулись, мне кажется, поскольку начали практически с нуля.

Есть широкий спектр технических проблем, связанных с этой работой. Одну я уже упоминал, а именно: по причине высокой насыщенности материала объем данных, которые нам надо собрать, невероятно большой. Эта проблема может быть решена в основном за счет увеличения ресурсов — просто покупкой большего количества носителей с надеждой на то, что цены на них снизятся. Кстати, они снизились: вы знаете, когда я начинал, понятие гигабайта казалось невероятным, и я вырос в мире, где память моего первого «Макинтоша» составляла 512 кб, а затем появилась возможность использовать целый мегабайт, и это было восхитительно. Обладать памятью в несколько гигабайтов было замечательно, но потом мы начали иметь дело с терабайтами, и терабайт казался необыкновенно большим, а теперь мы говорим: «О̓кей, терабайты не так уж страшны, но вот петабайты, тысячи терабайтов, — это действительно серьезно». Так что у меня есть чувство, что это не станет нашим Ватерлоо, точкой преткновения. Мы наверняка сумеем преодолеть это препятствие, хотя сейчас это проблема, но она не является основной.

Фундаментальная проблема — та, что мешает мне спать по ночам, — как проанализировать такое количество данных. Мы исследовали кусочек мозга мыши, одну миллиардную часть объема мозга взрослой мыши, в течение последних четырех лет. Это все, чем мы занимались, — анализировали один крохотный кусочек, и просто удивительно, сколько всего можно извлечь из чего-то столь малого. Очень сложно представить такой анализ в более крупных масштабах. Такое ощущение, что в этой сфере, как и в других областях биологии, инициативу перехватят более талантливые люди: математики, физики, инженеры, компьютерщики, и мы будем производить данные, которые они затем будут анализировать, потому что мы всего лишь любители по части анализа. Мы знаем, какие вещи было бы интересно исследовать, но нам не очень хорошо удается создание инструментов для анализа. Так что, думаю, это будет расцвет нашего направления, который еще на самом деле не произошел, а только начинается.

Большой вопрос в области коннектомики и создания подобных инструментов: куда это нас приведет? С радикальной и в определенном смысле даже захватывающей точки зрения если у вас есть полная карта связей в мозге, если наш инструмент действительно вам ее предоставил, то вы могли бы облечь эту архитектуру связей в кремний. Вы могли бы создать виртуальный мозг, который симулирует не только общее строение, но воспроизводит каждый синапс реального физического мозга. Следовательно, у вас может быть разум — такой же, как и биологический разум, но воссозданный на компьютере. Это один интересный подход.

Другая идея, похожая на научно-фантастический сюжет, достаточно провокационная и все еще фантастика, и она состоит в том, что при появлении карты связей, как эта, вы сможете запустить ее в космос со скоростью света. Если бы разумное сообщество где-то очень далеко от Земли захотело бы получить впечатление о том, что мы собой представляем, то вместо отправки наших тел можно было бы отправить наш разум.

Джефф Лихтман