Пептидные вакцины: ЭпиВакКорона и другие
Пептидная платформа — одна из нескольких, на которых в теории можно делать вакцины. Ее суть заключается в том, чтобы взять белковый фрагмент патогена (бактерии, вируса, раковой опухоли) — пептид, и доставить его в организм. После встречи с пептидом иммунная система должна научиться бороться с ним. Столкнувшись с реальным патогеном, содержащим этот пептид в виде фрагмента белка, иммунитет защитит организм от болезни — или, по крайней мере, от самых неприятных последствий заболевания.
На тех же принципах работают и другие вакцины, разница только в размерах «платформы»: в цельновирионных препаратах — против оспы, клещевого энцефалита, в отечественном КовиВаке и китайских вакцинах от коронавируса — используют патоген целиком. В субъединичных вакцинах — к их числу относится большая часть вакцин от гриппа — используются крупные фрагменты патогена. Новые технологии позволяют использовать не сам патоген и не его фрагменты, а генетическую информацию для производства отдельных частей патогенов внутри наших клеток: так устроены мРНК-вакцины Pfitzer и Moderna, а также Спутник V.
Пептидная платформа подразумевает использование очень маленького фрагмента патогена, размерами сильно уступающего и целому, и белкам, и их субъединицам. Пептид — это короткая цепочка аминокислот, от нескольких штук до сотни. Для сравнения, шиповидный белок коронавируса состоит из 1273 аминокислот. Пептидные вакцины давно кажутся хорошей идеей. Во-первых, пептиды легко производить. Для этого не нужно работать с активными патогенами –, а значит, не нужно соблюдать строгие меры безопасности, которые усложняют производство цельновирионных вакцин.
Пептиды можно собирать методами обычного химического синтеза, в то время как для производства белков нужны живые организмы — бактерии, такие как кишечная палочка. Вставив в ее геном соответствующую последовательность ДНК, можно заставить бактерию производить нужные белки; этот метод широко применяется для синтеза лекарств, но у него есть недостатки. Бактерии работают медленно; кроме того, в промышленном реакторе они живут –, а значит, эволюционируют и обмениваются генетической информацией, — что может приводить к мутациям и ошибкам синтеза.
Во-вторых, пептиды (по крайней мере в теории) безопаснее белков. Последние, как правило, ядовиты: многие специфические белки раковых клеток и бактерий — опасные токсины, шиповидный белок коронавируса — тоже очень вредное вещество, способное повреждать нервные и мышечные клетки. В отличие от них, пептиды в организме быстро распадаются на отдельные аминокислоты, и навредить не успевают. Наконец, крупные фрагменты патогенов и белки запускают не один, а несколько видов иммунного ответа; эти реакции могут приводить к нежелательным эффектам. Маленький пептид должен вызывать всего один, предсказуемый тип иммунного ответа. А для большей эффективности можно использовать в одной вакцине несколько пептидов.
Давно разработана и принципиальная схема разработки и производства пептидной вакцины: на этот счет ВОЗ выпустила руководство еще в 1999 году. Но до 2020 года ни одна такая вакцина не применялась — и неспроста: разработать ее очень сложно. При помощи нескольких экспертов — некоторые из которых пожелали остаться анонимными — мы разобрались, как это может быть сделано, и как это могло быть сделано в «Векторе».
Выбираем пептид
Чтобы получить эффективную вакцину, нужно правильно подобрать пептиды. Искать их нужно в тех частях патогена, с которыми «работает» иммунная система. Казалось бы, самые заметные для нее части патогенов — обычно это поверхностные белки — состоят из сотен или тысяч аминокислот, а значит — десятков и сотен пептидов, и что-нибудь обязательно найдется. Но не все так просто. Белки — это сложно организованные клубки аминокислотных нитей. Подчиняясь законам физики, они скручиваются в причудливые структуры, для каждого белка разные. В такой структуре часть белковой нити скрывается в глубине клубка, а часть образует ее поверхность, где даже удаленные участки последовательности могут оказаться рядом.
Именно к поверхности крепятся антитела, на нее реагируют другие виды иммунной защиты. Антителам без разницы, как устроено место, к которому они крепятся, но нам, — разработчикам пептидной вакцины, — это важно. Если место крепления антитела (эпитоп) образовано несколькими удачно сложившимися изгибами, воссоздать его мы не сможем. Нам нужны такие части поверхности белка, которые состоят из единых участков белковой нити — линейные эпитопы. Для того, чтобы найти их, нам нужно внимательно рассмотреть белок или его 3D-модель.
Как это сделано в ЭпиВакКороне?
Создатели ЭпиВакКороны выбрали три пептида шиповидного белка коронавируса Sars-Cov-2. В опубликованной в журнале «Инфекции и иммунитет» статье не описывается методика выбора пептидов. Но судить об их положении в шиповидном белке можно по имеющимся 3D-моделям. Ниже приведена одна из них; красным цветом показан один из пептидов, входящих в состав ЭпиВакКороны. На изображении видно, что пептид находится не на поверхности белка; некоторые его участки скрыты другими частями молекулы.
Предположим, что мы нашли несколько линейных эпитопов. Теперь нужно проверить, к каким из них вырабатываются антитела. Все люди разные, и одни и те же фрагменты патогена могут вызывать ответ у одних, но не срабатывать у других. Мы хотим сделать вакцину, которая защитит большинство людей, поэтому эпитопы будем выбирать те, антитела к которым вырабатываются у 70, 80, а лучше 90% населения. Такие эпитопы называются иммунодоминантными.
Чтобы выяснить, к каким участкам белка антитела вырабатываются, а к каким — нет, ученые закрепляют отдельные пептиды S-белка на подложке и наливают на нее плазму крови переболевших ковидом. Через некоторое время находят те пептиды, с которыми связались антитела — так делается первичное картирование. У разных людей находятся разные пептиды. Чаще всего на один и тот же пептид реагируют антитела не больше чем у 20% переболевших ковидом людей. Но есть «горячие точки» — пептиды, с которыми реагируют антитела у 70% переболевших.
Затем избранные пептиды проверяют на способность помешать антителам связывать настоящий вирус и определяют самые эффективные. Этот метод позволяет составить «карту» иммунодоминатных линейных эпитопов белка, и найти пептиды, которые с большей вероятностью могут провоцировать выработку нейтрализующих вирус антител у человека.
Как это сделано в ЭпиВакКороне?
В начале 2020 года, когда разработчики ЭпиВакКороны приступали к работе, экспериментальное картирование иммунодоминатных линейных эпитопов вирусного S-белка коронавируса еще не было выполнено. Однако позднее как минимум шесть лабораторий в разных странах провели эту работу. Ни один из выявленных иммунодоминантных фрагментов вирусного белка не совпал с пептидами, вошедшими в состав ЭпиВакКороны.
Итак, «правильный» пептид должен быть линейным эпитопом, целиком расположенным на поверхности белка. При этом антитела, выработанные на этот пептид, должны уметь связываться с вирусным белком и должны уметь нейтрализовать вирус. Однако недостаточно просто синтезировать такой пептид и вставить в вакцину. Важно еще и стабилизировать его в той геометрической форме, которую он имеет в природном белке. Отделенный от основной цепочки, пептид может изменить форму: то, что было петлей, станет нитью, спиралью и т.п. Потеря формы в биохимии означает потерю функции: тщательно выбранный пептид может оказаться бесполезным в своей новой геометрии.
И еще один важный момент: выбранный пептид (или соответствующий ему эпитоп) в белке должен быть одинаковым у большей части вариантов патогена. Бактерии и вирусы быстро эволюционируют, и аминокислотны, последовательность, а также структура их белков (особенно тех, что часто подвергаются атаке иммунитета) меняется от штамма к штамму. Для вакцины нужно выбрать консервативные участки, которые с большой вероятностью будут идентичны у разных штаммов бактерии, вируса или у разных вариантов раковой клетки.
Как это сделано в ЭпиВакКороне?
В публикации исследователей из центра «Вектор» нет описания трехмерной структуры пептидов — ни в составе шиповидного белка, ни в свободной форме, ни в форме, которую пептиды приобретают, связываясь с белком-носителем. Собеседники «ПМ» считают, что создатели ЭпиВакКороны не исследовали трехмерную структуру пептидов ни в каком варианте.
Создатели ЭпиВакКороны неоднократно заявляли, что с самого начала ставили цель подобрать консервативные участки шиповидного белка — так, чтобы вакцина не теряла эффективность по мере появления новых штаммов коронавируса. Парадоксальным образом эта стратегия могла исключить из кандидатов в пептиды иммуногенные участки белка — те, к которым с большой вероятностью образуются антитела. Ольга Матвеева, молекулярный биолог и основатель биотехнологической компании Sendai Viralytics, а также другие консультанты «ПМ», считают, что создатели ЭпиВакКороны выбрали действительно консервативные участки. Они очень редко меняются, но с антителами взаимодействовать, скорее всего, не могут –, а значит, вряд ли способны защитить от коронавируса.
Подключаем средство доставки
Эксперимент продолжается. Мы нашли на поверхности патогена консервативные, линейные, иммунодоминантные эпитопы, которые вне белка сохраняют функциональную форму (или мы научились стабилизировать их в нужной форме). Можно ли просто взять и впрыснуть эти молекулы в организм? Увы. Ферменты, странствующие в межклеточной среде, быстро расщепят их на отдельные аминокислоты. К тому же пептиды слишком малы, и иммунные клетки плохо «видят» их.
Пептиды нужно модифицировать так, чтобы продлить им жизнь и сделать их крупнее. Есть много вариантов: можно посадить пептиды в липидную каплю или на другую наночастицу, можно защитить от ферментов химической модификацией, удлинить их, связав между собой, или прикрепить к белку-носителю. С некоторыми из этих методов могут возникнуть сложности: удлиненные молекулы могут не дать правильного иммунного ответа, а белок-носитель может привести к появлению антител к нему самому, никакого отношения к защите от настоящего патогена не имеющие. Выбор не из легких.
Как это сделано в ЭпиВакКороне?
Каждый из трех пептидов, входящих в состав ЭпиВакКороны, закреплен на основании из модифицированного нуклеокапсидного белка коронавируса (N-белка). Вирусный N-белок, по имеющимся на середину 2021 года данным, не провоцирует выработку нейтрализующих антител (с этим согласны и создатели ЭпиВакКороны). Однако нецелевые, балластные антитела к нему вырабатываться могут. Собеседники «ПМ» считают, что именно антитела к этому белку в крови привитых ЭпиВакКороной составляют основной массив антител, детектируемых специальной тест-системой, разработанной в центре «Вектор». Тот факт, что коммерческие тест-системы не обнаруживают антител в крови привитых этой вакциной, также объясняется наличием антител к белку-носителю.
Проверяем на иммуногенность
Ура! Пептидная вакцина почти готова. Осталось ее протестировать. В самом общем виде нам нужно проверить препарат на три параметра: безопасность, иммуногенность и протективность. Иммуногенность — это способность вызывать иммунный ответ. Протективность — это способность защитить от заражения или некоторых вариантов течения заболевания. Вакцина может быть иммуногенной, но не протективной, но без иммуногенности о защите от заболевания говорить, конечно, нельзя.
Проверку на иммуногенность начинают с животных. Им вводят вакцину — в нашем случае пептиды, соединенные с носителем, — выжидают время, за которое должны появиться антитела, затем забирают кровь и исследуют ее. Обыкновенного анализа на антитела здесь будет мало, потому что они бывают разные. Нам нужно проверить, получилось ли у нас вакцинацией заставить организм животных вырабатывать нейтрализующие антитела — именно те, что способны обезвредить патоген.
Поэтому для эксперимента нам понадобится сам вирус. Работать с живыми патогенами, вызывающими опасные заболевания, сложно и дорого, поэтому иногда можно обойтись и целевыми фрагментами — например, теми белками, из которых мы отобрали свои пептиды. Но и здесь важно помнить о том, что патоген или его части должны быть точно такими же, как у активного вируса или живой бактерии. Добиться этого не всегда просто: белки легко меняют форму (денатурируют) от химической обработки, повышения или падения температуры.
Денатурированный белок теряет структуру и обнажает ранее недоступные эпитопы, с которыми могут связаться антитела из крови наших подопытных животных. Качественные реагенты — залог успеха. Лишь после прохождения этого этапа мы можем приступить к исследованию на людях. После вакцинации добровольцев нужно будет повторить тесты на наличие нейтрализующих антител в крови, проверив их активным патогеном.
Как это сделано в ЭпиВакКороне?
В статье создателей вакцины содержится прямое указание на то, что для исследования плазмы крови подопытных животных использовался шиповидный белок коронавируса, который до эксперимента был денатурирован специальным раствором. По мнению Ольги Матвеевой, использование частично денатурированного белка даже после последующей ренатурации могло исказить результаты эксперимента и привести к ложному заключению разработчиков вакцины о способности антител вакцинированных животных связываться с белком коронавируса и, соответственно, с самим вирусом.
Добровольцы, участвовавшие в третьей фазе клинического исследования ЭпиВакКороны, самостоятельно сдавали анализы в коммерческих лабораториях и не обнаружили у себя антител. Они решили, что попали в группу плацебо;, но когда отрицательных результатов стало много, инициативная группа ученых, сформировавшаяся из группы добровольцев при участии вирусолога Александра Чепурнова, провела собственный эксперимент для определения не только уровня антител к вирусу, но и уровня именно защитных антител, в том числе способных нейтрализовать вирус.
Инициативная группа добровольцев собрала плазму крови людей, вакцинированных ЭпиВакКороной, Спутником V, а также переболевших Covid-19, и отправили их в зашифрованном виде в лабораторию класса BSL3, аккредитованную для работы с опасными патогенами. Там с образцами провели реакцию нейтрализации коронавируса. Нейтрализующие коронавирус антитела обнаружились у переболевших и привитых Спутником V людей, но только у одного человека, привитого ЭпиВакКороной — как выяснилось позднее, все же переболевшего перед забором крови. Эти результаты заставляют усомниться в иммуногенности вакцины, в ее способности провоцировать выработку нейтрализующих вирус антител –, а значит, и в ее способности защищать людей от болезни.
Есть ли будущее у пептидных вакцин?
Собеседник «ПМ» из структуры Минздрава полагает, что пептиды — плохие кандидаты для вакцины, которая должна стимулировать выработку антител. Слишком сложно соблюсти все условия: найти у патогена консервативные линейные эпитопы, к которым у большинства людей могут вырабатываются антитела, стабилизировать их на частице-носителе — да так, чтобы иммунные клетки правильно распознали пептид и в ответ смогли бы синтезировать нейтрализующие антитела, не реагируя на сам носитель.
Но антитела — не единственное оружие организма в борьбе с патогенами. У иммунной системы есть другие виды вооружений, клетки — Т-киллеры и Т-хелперы. Работают они в точности так, как следует из названия: едва заметив на поверхности клетки чужеродные молекулы, которые сигнализируют о том, что в нее проник вирус, Т-киллеры атакуют и убивают клетку. Иммунитет, который дают Т-клетки, называется клеточным.
Разработки пептидных вакцин, ориентированных на формирование клеточного иммунитета, ведутся не только и не столько по коронавирусу. Гораздо раньше их начали создавать для борьбы с некоторыми видами рака и малярией. Над созданием такой вакцины от Covid-19 сейчас работают иммунологи из университета Тюбингена; недавно она вошла в первую стадию клинических исследований.
Неизвестно, станет ли такая вакцина эффективным средством борьбы с текущей пандемией. По некоторым данным, клеточный иммунитет не способен надежно защитить от Covid-19 — к такому выводу пришла группа российских ученых, хотя результаты этой работы еще не опубликованы. Это не значит, что работать над пептидными вакцинами не нужно. Патогены бывают разные, и борьба с ними тем эффективнее, чем больше разных способов мы сможем применить. Новые вакцинные платформы появляются и проходят проверку; не все вакцины оказываются удачными, и это нормально.
