Нейробиологический проект Rybka Project
Память человека и позвоночных животных до сих поростается одной из главных загадок нейробиологии. Несмотря намногочисленные исследования, окончательного ответа на вопрос «где вмозгу хранится запоминаемая информация?» до сих пор не найдено.Пролить свет на этот вопрос призван и наш проект: изучениемолекулярно-биологических механизмов долговременной памяти с помощьюрыбки данио-рерио (Danio Rerio) англоязычном обиходе известной как«zebrafish».Это популярная лабораторная рыбка, являющаяся стандартныммодельным организмом в исследованиях по эмбриологии, стволовым клетками др. Геном данио секвенирован, что упрощает её генетическуюмодификацию.Врезка о модельных организмах
Поскольку основныммотиватором биологических исследований является медицина, можносказать что «главным» является единственный вид HomoSapiens, а всеостальные являются «моделями», на которых можно ставить эксперименты.Поэтому такие организмы называются модельными. Диапазон их чрезвычайноширок: от бактерии до шимпанзе. Среди стандартных модельных организмовприсутствуют кишечная палочка E. Coli, хлебные дрожжи, червячок-нематода C. Elegans, мушка-дрозофила, рыбка данио, лягушка, аксолотль, мышь и крыса, курица, 2 вида макак, шимпанзе. Каждыйорганизм хорош для определённых типов экспериментов: так напримербактерии быстро эволюционируют, поколения могут сменяться за минуты, аксолотль используется для экспериментов по регенерации, а высшиеприматы — для изучения когнитивных способностей, возникновения речи, интеллекта и пр. Многие модельные организмы имеют чистые линии — выведенные путем близкородственного скрещивания. Такие организмыназываются линейными, любые 2 особи из одной линии имеют практическиидентичные геномы.Наш герой — данио-рерио, популярная аквариумная рыбка из семейства Карпообразные, известентакже как брахиданио рерио или зебрафиш (zebrafish). В дикой природеэта рыбка обитает в бассейне Ганга в Индии и сопредельных странах.Данио может вырасти до 6–7 сантиметров, довольно неприхотлив ваквариумном содержании и легко размножается. Эмбриогенез данио длится48 часов, после чего формируется личинка, половой зрелости рыбкадостигает в 3 месяца. Известно более 10 лабораторных линий данио, егогеном расшифрован, рыбка имеет 25 хромосом.
Рыбка имеет достаточно сложный мозг, чтобы бытьспособной обучаться и для наличия памяти. Так, например, она можетнаучиться проходить простейшие лабиринты, плыть за кормом вопределённое место по звуку колокольчика, и некоторым другим несложным«трюкам».С другой стороны рыбка — это рыбка, т.е. водное животное с внешнимоплодотворением, что очень сильно облегчает её генетическуютрансформацию и выращивание. Действительно, не требуется выделятьяйцеклетки, оплодотворять их in vitro, а затем внедрять имодифицированную зиготу в матку, как это бывает у млекопитающих.
Рисунок 1. Даниорерио обычный («дикий»), вверху иего малёк, внизуСледующее важное качество рыбки- тело ее способнопропускать свет. У «диких» форм данио (рис. 1) прозрачны толькомальки, однако существует специальная порода под названием Каспер, неимеющая пигментов (рис. 2).
Рисунок 2. Данио породы Каспер
Касперы почти прозрачны даже во взрослом возрасте, что позволяет неинвазивно заглядывать к ним внутрь, то есть изучатьто, что происходит в них внутри с помощью обычной камеры и безоперации, в процессе их обычной жизнедятельности. В эксперименте, мыбудем использовать технологию светящегося белка, что позволитподсветить интересующие нас процессы в рыбе, подробнее об этом ниже.Вот почему мы выбрали данио для нейробиологического проекта, которыйтак и называется Rybka Project (http://rybka.org.ua).Наш проект направлен на изучения механизмов долговременной памяти, ееконсолидации (перехода кратковременной памяти в долговременную), атакже синаптической пластичности. Согласно литературе[1–4] в процессе формирования памяти участвует несколько десятковбелков.Наша задача — исследовать активность некоторых из них в реальныхусловиях, динамику их синтеза во времени и пространстве (распределениепо областям и фрагментам мозга). Для этой цели мы собираемсяиспользовать такие генетические модификации (трансфекции) рыбки, при которых с промотороминтересующего нас гена (который кодирует нужный белок) соединяетсяучасток ДНК, кодирующий GFP (green fluorescent protein, зелёныйфлуоресцентный белок).Таким образом мы делаем так что экспрессия нашего целевого гена влечеттакже синтез флуоресцентного белка, который светится при освещенииультрафиолетом. Это делает видимыми мозговые процессы, происходящие сучастием этого гена.Такая методика в последнее десятилетия стала довольно популярной, втом числе и в экспериментах с рыбкой [5]. На технологии светящегосябелка основан также эксперимент, близкий к нашему, который описанздесь (http://habrahabr.ru/sandbox/57219/).
Рисунок 3. Zif268 связывается с ДНК.
Для примера рассмотрим один из «белков памяти», которые фигурируют в нашем проекте. Он называется zif268 (рис. 3) иявляется металлопротеином, т.к. «готовая» белковая молекула включает всебя два атома цинка. Кроме того, он является транскрипционнымфактором и способен взаимодействовать с ДНК.После того как трансгенные рыбки будут выращены, нашей задачейявляется наблюдение за ними с помощью камер высокого разрешения –таких, которые позволят в подробностях разглядеть их мозг, зафиксировав интенсивность свечения зелёного белка в различных егочастях.При этом рыбки будут решать различные задачи на обучение и запоминаниетакие как прохождение несложных лабиринтов, выработка условногоповедения (напр. приплывание за кормом по колокольчику), освоениенезнакомой обстановки и др.Мы сможем увидеть, в каких частях и структурах мозга образуется тотили иной белок, отследить динамику его появления по отношению к сеансуобучения, связь различных белков с типом образов в памяти, и другиеинтересные факты.
Мы надеемся, что такие эксперименты позволят подойти ближе к раскрытиюсекретов памяти, понять механизмы длительного хранения информации вмозгу, а также дать ключ к разработке более реалистичных моделейбиологических нейросистем.Помимо основной задачи проекта также можно получить и другие, смежные результаты: от изучения экспрессии других групп белков у позвоночных до «производства» различных вариаций светящихся рыбок для аквариумов.
В данный момент проект находится наначальной стадии, идет теоретический анализ, дизайн протоколовтрансфекции (генетической модификации), методов регистрации и анализаданных. Планируется закупка рыбок, оборудования и реактивов. Ведётсятакже поиск средств для проекта, ведь в данный момент он не имееткакой-либо финансовой поддержки. Возможна подача заявки на грант, либоже краудфандинг.Есть успешный опыт краудфандинга для проекта «Iam a little mouse and I want to live longer!» , многие люди изкоманды которого также участвуют в Rybka Project.
Мы планируем публиковать новости о развитии проекта, и результатыисследований — когда они появятся. Приветствуются комментарии ипредложения от всех, кому это интересно.
Литература Garcia-Osta A. and Alberini C.M. (2009) Amyloid beta mediates memory formation. Learning and Memory. 16:267–272. Alberini C.M. (2009) Transcription Factors in Long-Term Memory and Synaptic Plasticity. Physiol Rev. 89:121–45. Chen DY, Stern SA, Garcia-Osta A, Saunier-Rebori B, Pollonini G, Bambah-Mukku D, Blitzer RD, Alberini CM. (2011) A critical role for IGF-II in memory consolidation and enhancement. Nature 469:491–497. Milekic, Maria H., and Cristina M. Alberini. «Temporally graded requirement for protein synthesis following memory reactivation.» Neuron 36.3 (2002): 521–525. Kimberly Dooley, Leonard I Zon, Zebrafish: a model system for the study of human disease, Current Opinion in Genetics & Development, Volume 10, Issue 3, 1 June 2000, Pages 252–256, ISSN 0959–437X, .
