Магнетит в зубах: секвенирование транскриптомов тканей радулы панцирного моллюска
Если верить статистике, то самыми страшными врачами являются стоматологи. Эти адепты бормашины и веселящего газа готовы на все, чтобы сделать себе бусы из ваших зубов. По крайней мере, так думают люди с дентофобией. На самом же деле труд стоматологов важен и нужен. Но вот кому стоматолог не нужен так это хитонам — панцирным морским моллюскам. Их зубы настолько прочны, что фраза «грызть гранит науки» приобретает буквальный смысл. Зубы на радуле хитонов покрыты минералом магнетитом, который эти морские обитатели вырабатывают самостоятельно. И вот ученые решили более детально изучить этот процесс в надежде получить новые сведения, которые могут помочь в создании новых сверхпрочных материалов. Как ученые проводили свои исследования «улыбок» хитонов, что им удалось обнаружить и как их открытия могут помочь людям — ответы на эти вопросы имеются в докладе исследовательской группы. Поехали.
Малакология
Хитоны или же панцирные моллюски являются классом морских моллюсков, покрытых раковиной. Вот такая вот тавтология. На данный момент насчитывается порядка 1500 видов, обитающих в самых разных географических регионах и водных слоях (от мелководья до глубин в 2500 м). Первая особенность, которая бросается в глаза, это их панцирь. Он состоит из 8 пластин, соединенных между собой достаточно подвижно, что позволяет хитонам в случае опасности сворачиваться в клубок.
Хитон вида Cryptochiton stelleri.
Если сказать, что родословная хитонов очень древняя, то это будет преуменьшение, ибо некоторым останкам предков хитонов (окаменелостям) примерно 400 000 000 лет. При этом львиную долю человеческой истории эти морские жители были затворниками — первые описания хитонов датируются 1758 годом за авторством шведского ученого Карла Линнея.
Радула хитона.
Кошмаром любого стоматолога является рот хитона, оснащенный радулой с несколькими рядами зубов по 17 штук в каждом. Еще раз скажем спасибо эволюции, что эти создания вырастают максимум до 35 см и питаются микроскопическими водорослями, а не людьми. Каждый из зубов покрыт магнетитом, что помогает им соскабливать свое пропитание с любой поверхности.
И вот именно эта особенность и заинтересовала ученых. Каким образом хитоны вырабатывают магнетит, делающих их зубы одними из самых прочных в природе?
Магнетит
Магнетит (Fe3O4 / оксид железа), как вы уже могли догадаться из названия, обладает сильными магнитными свойствами, помимо этого он является полупроводником. Редким этот минерал не назовешь, однако одно дело добывать его в каких-то горах и совсем другое — вырабатывать его своим же телом для придания прочности зубам.
Итак, мы немного познакомились с главным героем сего исследования и с его «суперсилой». Теперь пора углубиться в само исследование и его результаты.
Основа исследования
О том, что некоторые организмы могут вырабатывать магнетит ученым известно достаточно давно. Среди таких организмов есть бактерии, пчелы, лосось и даже голуби. Однако с самого момента открытия такой особенности у хитонов в 1962 году механизм выработки магнетита не был описан полностью. Ученые отмечают, что интерес к хитонам возрос в разы после того, как магнетит, вырабатываемым Cryptochiton stelleri (вид хитонов), был признан одним из самых прочных биоминералов.
Еще одной важной особенностью хитонов является замена ряда изношенных зубов на новые, образующиеся внутри радулы, что позволяет проанализировать весь процесс минерализации. Первые 8–12 рядов зубы C. stelleri прозрачны и не имеют магнетита, а состоят большей степени из α-хитина и белков. Следом 2–5 рядов зубов темнеют до красновато-коричневого цвета, что визуально соответствует частичной минерализации посредством аморфного нанокристаллического оксида железа (ферригидрита). И самые последние ряды зубов уже обладают ярко выраженными черными выступами, что говорит о завершении процесса минерализации, то есть о переходе ферригидрита в магнетит.
Важный нюанс — поверхность радулы и основание зубов состоят по большей степени из α-хитина, а вот острие зубов состоит уже из минерала. А это значит, что существует ряд белков, определяющих специфику образования оксида железа и дальнейшего покрытия именно этой области магнетитом.
Для изучения этих процессов ученые провели ряд наблюдений, позволивших воссоздать транскриптом тканей радулы хитона C. stelleri из обеих областей — с минерализацией и без нее.
Результаты
Изображение №1
Зубы моллюска образуются внутри тканей радулы, где они окружены эпителиальными клетками (1а). Следовательно, белки, необходимые для их формирования, вырабатываются в этих же клетках.
Ученые выделили РНК из тканей радулы, дабы построить ряд экспрессированных последовательностей в этих тканях (транскриптом).
В качестве образцов для выделения РНК послужили ткани из трех участков (1а): первые 8–12 рядов зубов (без минерализации), 2–5 ряд (частичная минерализация) и 5–6 ряд (полная минерализация). Далее проводилось секвенирование РНК, то есть определение первичной структуры РНК. Данные из минерализованных и неминерализованных участков были собраны в 187980 транскриптов. Средняя длина одного транскрипта составила 705 bp (спаренных оснований / пар нуклеотидов), а максимальная достигала 16738 bp.
На изображении 1b схематически показан зуб хитона: мембрана радулы у основания, потом основная часть и острая вершина зуба (внешняя часть).
Таблица результатов секвинирования РНК C. stelleri.
Среди 20 наиболее экспрессированных транскриптов в неминерализованной области зубов пять транскриптов представляют собой изоформы белка Cs17717 | c0_g1. Также было выявлено 2 транскрипта перитрофиноподобных белков — Cs79475 | c0_g1_i1 и Cs70642 | c0_g2_i1, которые обладают хитин-связывающим доменом. Также важно отметить, что Cs25220 | c1_g1_i1 похож на белок Pif, который связан с биоминерализацией карбоната кальция у моллюсков. Таким образом вышеуказанные белки имеют хитин-связывающий домен 2-го типа.
Иная картина наблюдалась в двадцатке экспрессированных транскриптов в минерализованной области зубов. 35% из них составили ферменты митохондриальной дыхательной цепи. Также был обнаружен белок Cs12250|c0_g1_i1, участвующий в связывании хитина. Занятно то, что этот белок ранее был обнаружен в клюве кальмара. Порядка 25% транскриптов являются изоформами белка Cs22243 | c0_g7, чьи функции пока не изучены.
Ученые выделили ряд важных по их мнению белков, участвующих в процессе минерализации. Но самым важным они считают ферритин, который необходим для хранения и переноса железа. Ферритин формирует белковую клетку — своего рода ловушку, в которой помещается до 4500 атомов железа в форме минерала на основе оксида железа.
Таблица всех белков, связанных с минерализацией зубов C. stelleri.
А поскольку гены ферритина были обнаружены в тканях радулы испытуемых моллюсков, ученые смело предположили его причастность к процессу минерализации зубов.
Ученые провели анализ 134993 транскриптов на наличие признаков гомологии (генетического сходства) с генами ферритина. В результате было выделено 4 аминокислотные последовательности транскриптов.
Анализ четверки показал, что Cs90734|c0_g1_i1 обладает гомологией с секретируемыми ферритинами, а три оставшихся (Cs22563|c0_g1_i1, Cs75144|c0_g1_i1 и Cs17042|c0_g1_i1) более похожи на цитоплазматические ферритины.
Ученые также указывают на то, что ферритин Cs90734|c0_g1_i1 в отличие от своих «коллег» обладает некими структурными свойствами, присущими ферритинам секретируемого типа, а не цитоплазматическим.
Во-первых, у него имеется вставка примерно 40 аминокислотных остатков (аминокислоты вне пептидной последовательности). Во-вторых, связывающие металлы остатки заменены на другие аминокислоты. Единственное чего нет у Cs90734|c0_g1_i1 от ферритинов секретируемого типа так это сигнальных последовательностей.
Самый высокий показатель экспрессии был у одного конкретного ферритина — Cs75144|c0_g1_i1, который был, что занятно, более выражен в неминерализованной области зубов. Это говорит о его важности в процессе минерализации.
В общей сложности был выявлен 31 белок из основы зуба и мембраны радулы. Из них 22 были идентифицированы во время первого этапа анализа с помощью тандемной масс-спектрометрии. Эта методика также дала возможность понять, что пептидные последовательности из минерализованных участков зуба соотносятся с 232 транскриптами, а пептидные последовательности из основания зуба и мембраны — с 114 транскриптами.
Из области кончиков зубов было идентифицировано 77 белков (61 во время первого анализа и 54 — второго), среди которых стоит выделить следующие: миоглобин, актин, фактора элонгации 1 альфа и аргининкиназа (Cs77196|c0_g2_i1, Cs47470|c2_g3_i1, Cs24354|c0_ g1_i1 и Cs82664|c0_g1_i1, соответственно). Все они представлены двадцатью наибольшим образом экспрессированными транскриптами в неминерализированном участке зубов.
Во время поисков ответственных за минерализацию белков было использовано программное обеспечение Mascot, работающее на базе данных масс-спектрометрии и определяющее белки по пептидным последовательностям. Среди исследованных белков особое внимание получил ранее неопознанный белок Cs68435|c0_g1_i1, который не имел никаких общих черт с последовательностями других белков. Ученые дали ему название RTMP1 (матричный белок радульных зубов 1).
Пептидная последовательность белка Cs68435|c0_g1_i1 содержит остатки глицина и серина. Поскольку пять-штрих (5») этого белка был укорочен, общая длина последовательности была определена с помощью 5′-RACE.
RACE (быстрая амплификация концов кДНК) — метод получения двухцепочечных концевых участков кДНК, гомологичных 3'- или 5'-концам специфических молекул мРНК.
Полная аминокислотная последовательность нового белка RTMP1.
Общая картина последовательности такова: участки, обогащенные глицином и серином (GS), далее участки с триптофаном и фенилаланином (WF) и богатые гистидином (H) участки.
Ученые также выяснили, что выравнивание последовательностей WF участков из RTMP1 с хитин-связывающими доменами четырех бактериальных хитиназ (ферменты, активирующие процесс деградации хитина) показало: три из пяти предполагаемых остатков, взаимодействующих с хитином в хитин-связывающих доменах также присутствуют и в RTMP1.
Ученые определили профиль экспрессии транскриптов, связанных с минерализационными белками, в разные периоды минерализации. Примерно в 4 раза отличается уровень экспрессии некоторых транскриптов (например, нейроглобиноподобных белков, супероксиддисмутазы, пероксиредоксина-6 и т.д.) в участках зубов с и без минерализации. Уровень экспрессии меняется в зависимости от течения процесса минерализации. Другими словами, чем ближе к участку минерализации, тем ниже экспрессия одних транскриптов и тем выше экспрессия других (например белка RTMP1).
Для более детального ознакомления с исследованием настоятельно рекомендую заглянуть в доклад исследовательской группы и дополнительные материалы к нему.
Эпилог
Данное исследование впервые продемонстрировало транскриптом тканей радулы хитона. Ученым удалось выяснить, что наиболее экспрессированные транскрипты в неминерализованных участках содержат гены ферритина, а в минерализованных — ферменты митохондриальной дыхательной цепи.
Также исследователи выделили 22 белка в минерализованной области, среди которых был обнаружен совершенно новый — RTMP1. Именно эти белки и станут испытуемыми в дальнейших исследованиях минерализации оксида железа в хитонах.
Сей труд является первым шагом в понимании того, как образуются фактически минералы в биологических системах. Такие случаи не есть редкостью, но изучены на данный момент крайне поверхностно. В дальнейшем подобные знания могут помочь в создании новых методов выращивания тех или иных материалов, наделяя их очень полезными свойствами (прочность, электропроводность, намагниченность и т.д.).
Благодарю за внимание, оставайтесь любопытствующими и отличной всем рабочей недели, ребята.
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас оформив заказ или порекомендовав знакомым, 30% скидка для пользователей Хабра на уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5–2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps от $20 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
VPS (KVM) E5–2650 v4 (6 Cores) 10GB DDR4 240GB SSD 1Gbps до весны бесплатно при оплате на срок от полугода, заказать можно тут.
Dell R730xd в 2 раза дешевле? Только у нас 2 х Intel Dodeca-Core Xeon E5–2650v4 128GB DDR4 6×480GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $249 в Нидерландах и США! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5–2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
