ДНК-оригами. Guest Post
Привет, Хабр. Новый год в моём блоге начнётся со второго гостевого поста уважаемой Анастасии Новосадской @anastasiamrr — биолога и биоинформатика из Минска. Ранее Анастасия уже готовила для редакции Хабра пост о взломе и обфускации генетического кода на уровне ДНК, а также участвовала в подготовке материала об использовании нейросетей в современной биологии, опубликованного в блоге @SLY_G. На Хабре уже выходили посты о ДНК-оригами, как в авторских, так и в корпоративных блогах. Однако работа госпожи Новосадской даёт значительно более современный и не менее фундаментальный обзор проблемы, поэтому наверняка вас заинтересует. Далее — текст автора.
Привет Хабр! Большинству из нас известно, что «оригами» — это японское искусство складывания фигурок из бумаги, а ДНК — это биомолекула, двойная спираль из нуклеотидов для переноса и реализации генетической информации. Интересно: что между ними общего, как могла возникнуть технология ДНК-оригами и для чего применяют? Постараемся разобраться.
Предпосылки для возникновения и прикладного использования ДНК-оригами
Живые существа (и, в том числе, человек разумный) отличаются сложной внутренней и внутриклеточной организацией. Эволюция сформировала множество систем, которые призваны защищать наш организм от вторжений. Многие из этих систем реализованы на молекулярном уровне — и именно на молекулярном уровне действуют механизмы атаки, применяемые многими патогенами. По мере накопления знаний о физиологии, молекулярной биологии, биохимии, медицине и другим естественным наукам человечество училось, методом проб и ошибок, подбирать такие способы и средства, которые бы повышали шансы на выздоровление, улучшение и продолжение жизни. Но еще далеко не все такие механизмы изучены, а модели защиты и лечения не всегда показывают желаемый результат.
Одна из наиболее актуальных проблем фармакологии- прицельная доставка препаратов по организму, биодоступность А в настоящее время это направление становится одним из важнейших в клинической фармакологии. Такую практику называют «таргетная» или «прецизионная«терапия. Препараты, предназначенные для избирательного воздействия и работы именно там, где это необходимо (во избежание токсического воздействия на окружающие ткани и клетки), называют «умными лекарствами».
В настоящее время на таргетную терапию возлагаются большие надежды. Однако, с ней есть и проблемы. Весомым препятствием в доставке лекарств по организму к определенным органам и тканям являются биологические особенности тканей и клеток, а также работа иммунной системы и механизмы поддержания гомеостаза в организме. Например, если мы съедаем что-нибудь токсичное, яд не может проходить через ткани и задерживается в них, впоследствии сам претерпевает метаболические изменения внутри клеток — например окисление, восстановление, гидролиз, а также реакции конъюгации или реакции синтеза. К реакциям конъюгации можно отнести ацетилирование, метилирование и пр. Особенно активно это происходит в печени, где чужеродные для организма вещества подвергаются метаболической трансформации с последующим выведением через почки и кишечник. В случае с ядами это полезно и нужно. А вот с лекарствами — нет. Получается, что биологические системы защиты организма просто не позволяют лекарственным препаратам доходить до тех мест, где нужно провести терапию. Есть и ещё одна проблема. Наши клетки устроены таким образом, что они пускают в себя «нужные» им вещества и не впускают «ненужные». Многие лекарства, которые мы принимаем, могут проникать в клетки только в случае, если концентрация вещества очень высокая и система защиты просто не справляется. По сути, иногда приходится буквально перегружать печень и почки работой, чтобы они не успели уничтожить лекарство, пока оно будет работать. Более того, если же лекарство и попадает в клетку, которой требуется оказать терапевтическое действие, то сама эта клетка начнет сопротивляться и стремиться сохранить свой собственный гомеостаз. Клетка обрабатывает вещество ферментами, трансформирует его. В умеренно неприятном случае лекарство из-за этого становится бесполезным, а в худшем — токсичным. В настоящее время такие проблемы решаются разными способами, один из них — увеличение общей концентрации вводимого вещества, в надежде, что необходимое количество попадет «по адресу», не успев подвергнуться действию ферментов. На таком принципе основана классическая химиотерапия. Побочные эффекты такого подхода очевидны — если вещество вредное, то от него страдает весь организм, а не только орган-мишень. Несмотря на вышесказанное, увеличение концентрации вводимого вещества далеко не всегда прямо пропорционально улучшению состояния организма. Однако вред, как правило, при таком воздействии только увеличивается.
Другим способом является использование веществ, которые становятся лекарствами в процессе метаболической трансформации. Например, в крови человека возникает лекарство, которое не оказывает терапевтического действия. Оно попадает в клетку и метаболизируется ферментами этой клетки. В результате этой трансформации получается новое вещество, которое может оказывать терапевтический эффект именно в этой клетке. Преимуществом такого подхода следующее: получившееся «лекарство» не будет расщеплено клетками печени, которые способны обезвреживать широкий спектр веществ. Недостатком такого решения является все же невозможность создания лекарств для разных клеток и тканей для решения разных задач. По сути, создание подобных лекарств — обычно исключение, а не правило.
В настоящий момент взоры ученых устремлены на создание более универсальных препаратов. Представьте, что у человека болит только нога. Человеку приходится принимать лекарство, которое лечит не только ногу, а весь организм сразу. Чтобы достичь нужной концентрации лекарства в ноге, необходимо принять очень большое количество вещества. Для больной ноги это является вполне нормальным, а вот для остального организма нагрузка окажется чрезмерной. Что если попытаться доставить лекарство только в ногу, не пуская его в остальной организм? Возможно ли это? Да. Такой подход и называется таргетным.
Как же можно сделать так, чтобы лекарство попало только в «больную» ногу и не подвергалось метаболическим трансформациям за пределами ноги? Можно сделать местную инъекцию, а ногу перевязать жгутом. По крайней мере такой вариант приходит на ум. Но, по известным причинам, это не лучший вариант. Тем не менее, в данном случае мы сознательно делаем инъекцию в больное место, минуя большинство путей защиты. Можно ли это сделать так же, но не перевязывая ногу, или руку, или голову? Да. Например, если лекарство «упаковать» в «контейнер» который будет путешествовать по организму и не откроется только в нужном месте. В настоящий момент применяется несколько вариантов таких контейнеров, в частности, везикулы или фуллерены. Cитуация как при инъекции через шприц. Разница только в том, что место для инъекции выбирает человек, а момент раскрытия контейнера определяется специфической реакцией на «контейнере» с лекарством — именно эта реакция его и раскупоривает. Такой подход потенциально очень эффективен. Лекарство, попав в клетку, остается внутри неё и удерживается мембраной клетки — аналогично лекарству в перевязанной жгутом ноге. Недостатком такого метода является необходимость прорабатывания механизмов «открытия» контейнером. Помочь с этим как раз и могут ДНК-оригами.
Технология ДНК-оригами. Устройство и принципы
В ДНК-оригами нуклеотиды применяются вовсе не для хранения или передачи генетической информации и уж тем более не для использования в генной терапии, а как раз для воспроизведения пространственных структур, выполнения логических операций, доставки и катализа действующих веществ.
Поговорим о ДНК и нуклеиновых кислотах в целом. Нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, занимают особое положение среди всех остальных химических соединений в организме. Почему так вышло? Все из-за того, что нуклеотиды А, Т, Г, Ц, У способны соединяться друг с другом. Они имеют по 2 сайта связывания с образованием фосфодиэфирной ковалентной связи (), а также располагают к образованию связей на основе азотистых оснований. Такая особенность позволяет нуклеиновым кислотам составлять разнообразные конструкции. Эти конструкции могут как переносить информацию, (словно в них реализована письменность с использованием четырёхбуквенного алфавита), так и строить разнообразные геометрические структуры: двойная спираль ДНК, рибосомы, транспортные структуры (тРНК) и многое другое. По сути, клетка приспособлена к генерации внутри себя самых разнообразных сборок, где нуклеотиды используются по принципу конструктора.
Например, на уровне ДНК возможна регуляция многих процессов. Существуют генные сети — такие группы генов, которые координированно функционируют и взаимодействуют друг с другом через РНК и белки. Путём таких взаимодействий можно не только изменить фенотип организма, но и регулировать метаболические процессы. Пример такого взаимодействия — апоптоз (запрограммированная гибель клетки).
Лиганд FasL взаимодействует c Fas-рецептором, локализованным в клеточной мембране. В результате этого происходит активация 4-каспазного каскада — пути передачи сигнала, основанного на взаимной активации протеаз. Этот сигнал и активирует апоптоз. Гены транскрибируются, а затем транслируются, в результате клетка погибает.
ДНК также используется для обеспечения адаптивного иммунитета у бактерий и архей. Такова, например, системаCRISPR-Cas9, за исследование которой Дженнифер Даудна и Эммануэль Шарпантье были удостоены Нобелевской премии по химии в 2020 году. У бактерий и архей есть специфические кластерные повторы, которые называются CRISPR, между которыми находятся спейсеры. Спейсеры отличаются друг от друга. Более того, они повторяют участки генома некоторых вирусов, атакующих клетку. Cas-белки обнаруживают ДНК/РНК вируса и, если фрагмент «записан» в спейсерном участке, разрезают последовательность «чужака» на кусочки. В эукариотических клетках они также могут работать, поэтому данную систему используют в генной терапии и ГМО-разработках.
И тут есть очень интересный нюанс. Если клетки способны собрать внутри себя различные структуры, используя только нуклеотиды, то и ученые тоже могут это сделать. Например, как инженеры-машиностроители собирают автомобили из различных деталей, так и биоинженеры могут изготавливать «машины», используя методы молекулярной биологии. Технология изготовления наноструктур из нуклеотидов получила название ДНК-оригами.
Биологические принципы ДНК-оригами
Не секрет, что для создания различных ДНК и РНК структур внутри клетки природа разработала ряд процессов, позволяющих манипулировать нуклеотидами. Первым и самым важным процессом является транскрипция.
Транскрипция это сложный процесс, суть которого сводится к созданию «резервной копии» гена, записанного на цепочке ДНК. Ещё раз напомним, что мы с вами состоим из белков, которые сложены и организованы определенным образом. А белки состоят из определенной последовательности аминокислот. От этой последовательности зависит, какую функцию будет выполнять готовый белок. В свою очередь для создания нужной последовательности требуется инструкция, по которой в клетке будет производиться сборка белка. Эта инструкция хранится в генах, а гены хранятся в ДНК. Таким образом, ДНК можно сравнить с технической документацией. На производстве работают люди, но есть ли у людей оригинал документации? Нет, только копия, зачастую — не одна. На уровне клетки процесс создания копии — это и есть транскрипция, где информация о гене передаётся в новую «временную» последовательность с образованием полинуклеотида РНК. Поскольку единственное назначение такого нуклеотида заключается в том, чтобы кратковременно переносить информацию с главного «документа» к «исполнителям», такая РНК называется «информационной» — (иРНК).
Второй важный в данном контексте процесс — трансляция. Если подбирать популярную аналогию, то трансляция — это процесс создания деталей или машин на производстве по известной технической документации. Единственная поправка тут это то, что технической документацией является копия ДНК в виде иРНК, а деталями являются новые белки. Уже на основе РНК происходит последовательная сборка аминокислот в небольшие пептиды или протяжённые белки.
Ещё одним важным процессом является рестрикция. Рестрикция это разрезание ДНК в определенных местах. Биологический смысл этого процесса очень простой. Например, изменение последовательности нуклеотидов в ДНК путём вырезания лишних кусочков или вовсе порча ДНК. Кстати, таким часто пользуются, например, бактерии, чтобы защищать себя от ДНК вирусов. Представьте что на производство медицинской техники проник шпион и подкинул другую документацию с целью изменения производства. Главный технолог смог вовремя обнаружить опасные документы и уничтожить их, пока с них не сняли копию и не отправили на производство.
Исследователи же используют последовательность нуклеотидов в качестве своеобразного «каркаса» для будущих многомерных структур, которые будут являться своеобразными подложками. В живой клетке такими структурами являются например последовательности РНК, соединенные таким образом, что могут переносить аминокислоты внутри клетки. Такие структуры называют транспортными РНК (тРНК). Также, есть структуры, в которых происходит синтез белка. По сути специфическая «машина», куда попадает техническая информация иРНК о том, какой белок нужно сделать, и эта «машина» изготавливает нужный белок из аминокислот, которые транспортируют тРНК. Такие специфические «машины» называются рибосомами и образованы они тоже из нуклеиновых кислот и белков, а именно рРНК.
Как же устроен «каркас» и какие условия важны для сборки? Давайте рассмотрим это на примере транспортной РНК.
Строение тРНК
Биологическая роль этой молекулы — адресная (специфическая) доставка (активированных)аминокислот в зависимости от кодона во время трансляции белка. Рассказ о том, как образуется «правильный» порядок «кирпичиков» — это материал для отдельной статьи (). В данном случае интереснее обсудить как происходит перетаскивание и доставка аминокислот. Обратите внимание на причудливую форму тРНК. На первый взгляд сложная структура этой молекулы в самом деле напоминает оригами. Учёные назвали такую структуру «клеверным листом». Что позволяет цепи РНК сохранять такую форму? Это принцип комплементарности.
РНК (как и ДНК) состоит из нуклеотидов, которые могут соединяться как последовательно, так и параллельно. Но последовательно могут соединяться любые нуклеотиды через сахарофосфатный остов, а параллельно — только определённые, причём, попарно друг с другом через водородные связи (это постулат. Есть мутации и прочие факторы, которые могут его нарушить).
Если вы посмотрите на структуру тРНК, то обнаружите, что в местах, где есть разные нуклеотиды, например A напротив U и G напротив C, сами нити объединены в попарно. Нити обёрнуты друг вокруг друга, а нуклеотиды соседних цепочек расположены параллельно. Это означает, что нуклеотиды образуют комплементарные связи. Там, где комплементарность нарушается — образуются пустоты. Это петли 1, 2 и 3.
А теперь самое интересное. Такая цепь тРНК может присоединиться к ЛЮБОЙ другой цепи мРНК. Соединяются они между собой с помощью петли 3 тРНК, на которой находится триплет (3 штуки) нуклеотидов, называемый антикодоном. Антикодон является антипараллельным (ориентированным в противоположном направлении) для последовательности мРНК, к которой присоединяется. Таким образом, тРНК может присоединяться к информационной нити РНК только в том месте, где находятся антипараллельные нуклеотиды. Больше нигде. Такое соединение называется «гибридизация ДНК» На противоположном конце тРНК находится аминокислота, которая соответствует кодону информационной РНК, она потом уже будет включаться в реакцию синтеза белка.
Подвергаясь гибридизации, РНК и ДНК могут образовывать структуры разной формы. По сути стратегии применения могут быть абсолютно разные. Самое интересное, что при этом в большинстве случаев ДНК-оригами сохраняет реакционную способность и может взаимодействовать с окружающими молекулами. Например, к таким структурам можно присоединять лекарства, люминесцентные группы (молекулы, способные светиться под действием возбуждающего света (или другого источника энергии), разнообразные белки.
В сущности, ДНК-оригами — это и есть сборка из ДНК конструкций произвольной формы. При этом конструкции могут быть самые разные. Хоть в форме смайлика, хоть в форме паучка (с ножками из ДНК). Причём, конструкции могут находиться как в одной плоскости (двумерные/плоские), так и в нескольких (трёхмерные/объемные). Просто посмотрите на то, что получилось у биологов.
Варианты сборки ДНК-оригами
Надеюсь, теперь принцип строения достаточно понятен. Давайте перейдем от строения и теории к реализованным кейсам. Их достаточно много, все со своими плюсами и минусами. Разберемся с некоторыми из них.
Примеры использования ДНК-оригами
ДНК-оригами достаточно успешно применили в терапии и диагностике рака. Такое направление в принципе является довольно перспективным для исследований. Например, ученые поставили такой эксперимент. Они создали ДНК-оригами нескольких форм (треугольник, квадрат, трубка). После этого на полученные фигурки нагрузили доксорубицин (вещество с двоякой активностью: антибиотической и противоопухолевой) и ввели в экспериментальных мышей. Сооруженная конструкция оказалась настоящим оружием массового поражения опухолевых клеток. Причем наиболее высокой активностью отличилась именно треугольная ДНК-оригами. Однако обоснования такому явлению не нашлось.
Особой токсичности это не вызвало, в отличие классической химиотерапии, упомянутой в
самом начале. Явление продемонстрировано при лечении рака молочной железы, правда, не у человека, а у мышей. Но принципиально такая безопасная платформа для доставки препарата, собранная из генетического материала — впечатляет.
После введения оригами в мышь, было продемонстрировано великолепное биораспределение и оптимальное накопление вокруг опухоли. Затем в Оригами интеркалировали доксорубицин в стыковочные узлы (комплементарные пары). Вводили в мышь, оригами доставлялись через кровообращение и накапливались в опухоли благодаря EPR-эффектам (EPR означает «повышенная проницаемость и удержание»). Такая точная и эффективная доставка как раз и должна использоваться в прецизионной медицине.
Вторым интересным вариантом применения ДНК-оригами является разработка биосенсоров. Это междисциплинарный проект на стыке биологии и электроники. Особенностью такого сенсора является возможность определения специфических веществ, которые не возможно определить на основе химико-физических методов. Мы уже знаем, что ДНК оригами обладает высокой специфичностью к субстрату. В основе сенсорной части вновь лежит гибридизация. Общим принципом данных биосенсоров является изменение какой — либо физической характеристики, произошедшей при гибридизации. Так, при гибридизации ДНК с целевым веществом, могут изменяться оптические характеристики растворов или флуоресцентных меток, прикреплённых к ДНК. Может происходить изменение электрической проводимости и многое другое. Датчики, получающие сигнал от биологического агента — ДНК, делят в зависимости от типа преобразователей на оптические, электрические, механические, электрохимические и гравиметрические. В качестве примера можно привести геносенсор.
В упоминаемом здесь исследовании был создан ДНК-аптамер. Он был специфичен для мишени. Более того, аптамер был модифицирован: к нему присоединили считыватель нанопор. Вы, вероятно, помните, что каждый нуклеотид имеет свою структуру. Нанопора разработана для того, чтобы идентифицировать нуклеотиды.
Через нанопору постоянно проходит электрический ток. Как только в пору попадает один из нуклеотидов — фиксируется изменение тока. Ввиду разной структуры нуклеотидов, ток по-разному меняется при прохождении разных нуклеотидов. На таком принципе основано нанопоровое секвенирование. Этот метод также позволяет обнаруживать индивидуальные биомаркеры.
Соответственно, модуляция ионного тока через нанопору при перемещении ДНК-оригами принципиально зависит от присутствия биомаркера в полости нанопоры. В исследовании легко обнаруживался С-реактивный белок, самый верный показатель воспаления и/или повреждения живых тканей. А значит, при возможной дополнительной модификации оригами реализуема и специфическая адресная доставка.
Слева показано, как работает оригами-биосенсор. Справа показан сенсор в двух состояниях: занятый и не занятый биомаркером.
Наконец, третий пример: ДНК-оригами оказалось весьма действенным средством в борьбе с почечной недостаточностью. В медицине N-ацетилцистеин считается универсальным препаратом для такой болезни. К сожалению, он не всегда может помочь. Часто приходится прибегать к удалению или трансплантации почки и использованию поддерживающей терапии. Исследователи вновь создали несколько форм ДНК-оригами (трубчатая, треугольная и прямоугольная) , пометили радиоактивными изотопами (для детекции местоположения) и ввели в больную мышь. Оригами эффективно накапливались в почках. Более того, они показывали терапевтический эффект, причём эффект от использования прямоугольных структур оказался сопоставимым с воздействием N-ацетилцистеина. Терапевтический эффект возникал потому, что оригами способны поглощать АФК (активные формы кислорода), которые являются токсичными для организма, и тем самым ослаблять окислительный стресс. Ещё один инструмент медикам в арсенал.
Схематичное представление эксперимента, структуры оригами и фото их накопления
Возможности применения ДНК-оригами в ближайшем будущем
На сегодняшний день уже разработано и продемонстрировано множество кейсов применения ДНК-оригами, но, как мы знаем, нет предела совершенству и технологические возможности постоянно расширяются. В дальнейшем планируется еще больше увеличить точность, скорость сборки оригами, также стабильность получаемых конфигураций.
В будущем программы для проектирования и сборки ДНК-оригами будут доступны для использования обычным людям, даже не обладающим глубокими познаниями в биологии. Проектирование и сборка ДНК-оригами достаточно хорошо оптимизируется. Такой подход называют молекулярным программированием. Уже сейчас существуют программные пакеты для проектирования и разработки всевозможных ДНК-конструкций. (https://github.com/estherlin/dna-origami) и для их оптимизации (https://github.com/cmhuang2011/MagicDNA).
Это направление не перестает развиваться, поэтому рано или поздно процесс сборки и моделирования ДНК-оригами может быть полностью автоматизированным .
Также ведутся исследования по внедрению ДНК-оригами в структуру молекулярных роботов. Это самый интересный кейс, ведь именно тут сплетаются множество направлений науки, от электроники и IT до биологии. Наконец, наиболее впечатливший меня пример — конструирование шаперонов. Поскольку ДНК-оригами уже поддаются воспроизведению с большой точностью, на них можно подвесить большое количество функциональных молекул, а соответственно, интегрировать множество функций. Многофункциональность как раз является одной из важных особенностей нанороботов. Как минимум им необходимо перемещение, возможность загрузки (веществ), точное взаимодействие с объектом и изменение состояния объекта. Уже показано, что нанороботы, собранные на основе ДНК-оригами, могут выполнять механический синтез молекул, ориентируя их нужным образом и сближая друг с другом. Вполне возможно, что в будущем будут получены готовые каталитические структуры на основе ДНК-оригами, которые будут стимулировать реакции между молекулярными компонентами и, возможно, даже вносить какие-то из компонентов конформационные изменения. Я думаю, что это будет что-то наподобие шаперонов и шаперонинов.
Также планируется создание бактериальных штаммов, способных к воспроизводству ДНК-оригами. Стоит верить в то, что это направление разовьется хотя бы потому, что уже было показано, что бактерии с неестественными парами оснований (нуклеотидов) могут успешно размножаться. Уже известны некоторые попытки создать продуцентов простейших ДНК-оригами. В дальнейшем, исследователи надеются открыть возможность для эволюционной оптимизации, которая привела бы к созданию еще более сложных структур с совершенно новыми функциональными возможностями. Уже получены бактерии, синтезирующие человеческий инсулин и другие гормоны. Коль скоро мы научились этому, то почему не сможем воспроизвести оригами?
Возможно, скептически настроенному читателютакая технология может показаться достаточно сырой и не готовой конкурировать с другими разработками. Может быть, она даже воспринимается как научно-фантастическая. Однако, в биологии нередки случаи, когда максимально бесполезные, на первый взгляд, исследования приводили к серьёзным достижениям, как в случае с применением агробактерий при исследовании опухолей у растений. Более того, такая технология медленно, но верно раскручивается и проявляет все большую эффективность, превращаясь из футуристичной в актуальную.
Сейчас, когда любому исследователю понятно, что изучение молекулярной структуры является ключевым в понимании функций любого биологического процесса. Особенно полезна возможность собирать молекулы разнообразных форм. Ведь от формы молекулы могут зависеть множество функций, и с этой точки зрения метод ДНК-оригами оказывается как никогда кстати. Вероятно, ДНК-оригами позволит расширить биосовместимость и биодоступность многих лекарств, удешевить процесс сборки сенсоров и выйти на новый уровень развития в медицине и электронике.
