Ядерный магнитный резонанс, ЯМР. Часть 2
Приветствую всех айтишников и технарей. Сегодня я намерен во что бы то ни стало продолжить свой рассказ о методе ЯМР-спектроскопии. В первой части мы слегка прошлись по теории лежащего его в основе эффекта и остановились на том, что мы можем записать спектр резонансного поглощения атомными ядрами УВЧ-излучения, который будет содержать набор сигналов, частота которых будет как-то коррелировать с их химическим окружением. Теперь предлагаю поговорить о том, как это может быть реализовано в железе.
Силовые линии магнитного поля в различных вариантах взаимного расположения магнитов. Нас интересует правый вариант.
Разумеется, началось всё с постоянных магнитов. Банально потому, что сверхпроводящих на то время (40-е годы) ещё не было. Неодимовых магнитов не было тем более, поэтому собирали всё на самых обычных ферритах. Как мы уже говорили, от магнитного поля требовались две вещи: высокая индукция и высокая однородность. Проще всего добиться этого, разместив два магнита так, чтобы их вектора поляризации были сонаправлены, как изображено в правой части картинки (выше). В таком случае по центру между этими магнитами возникает область, где силовые линии полей обоих магнитов сонаправлены и имеют довольно большой радиус кривизны. Чтобы соседствующие друг с другом одноименными полюсами магниты не разбежались, а также для концентрирования магнитного поля во внутренней части сборки, их помещают внутрь прямоугольной в сечении рамы из особого ферромагнитного сплава железа и называют это Н-схемой. Ну, потому что на просвет это всё выглядит как такая себе располневшая буква Н.
К слову сказать, в современных ЯМР-спектрометрах на постоянных магнитах такая схема применяется если не всегда, то весьма часто, ибо всё гениальное просто. Хотя сейчас, вооруженные методами компьютерного моделирования, инженеры активно рисуют в этих ваших Комсолах различные хитрые конфигурации в форме сегментированных тороидов или изогнутых гребенок, и даже что-то из этого воплощают в жизнь, но так пока и не смогли вытеснить почти столетнюю Н-схему с рынка.
Н-схема, уже в современном исполнении на неодимовых магнитах. Свободно продается на Али, к слову, так что желающим собрать свой ЯМР-спектрометр все карты в руки.
Довольно скоро стало понятно, что с постоянными магнитами в сильно высокие поля не уедешь. А на ферритах — так тем более, получить достаточно однородное поле даже в 2 Тл на них было уже нереально. А тут как раз и коммерческие сверхпроводящие магниты подъехали, и пошло веселье. Ну, где в электромагните найти максимально сильное и однородное поле, вопрос не стоит — на оси соленоида, разумеется. Там и нашли. Ну, чтобы поле было ещё однороднее, добавили ещё подстроечные соленоиды. Осталось только запилить систему охлаждения катушки сверхпроводящего магнита жидким гелием, а чтобы дорогой гелий не так быстро выкипал — охлаждать его снаружи ещё и жидким азотом. И к середине 70-х вопрос источника оптимального для ЯМР поля был, фактически, решен. Да, конечно, постепенно допиливали конструкцию, конфигурацию, материалы, в том числе и для того, чтобы снизить себестоимость высокополевых магнитов до сколько-нибудь адекватных значений, но принципиально всё уже было готово, осталось только засунуть образец внутриюь.
Немного отвлечемся от техники и поговорим про сам образец. В теории, образцом может быть вещество в любом агрегатном состоянии. И не только в теории. Запихнуть газовый образец в ЯМР можно, и таки запихивали, но есть проблемка. При н.у. газы весьма разуплотнены, а чувствительность ЯМР, как мы помним, не особо высока. Поэтому либо мы имеем слабый сигнал, либо надо сжимать газ. Но главное то, что газов-то в целом не так много, а уж газов, достойных запихивания в ЯМР — и того меньше. А ещё если их начать сжимать, многие из них перехотят быть газами. Поэтому газовый ЯМР остался экзотикой, которой занимаются полторы научных группы в мире. Твердые образцы тоже можно запихнуть в ЯМР, и таки пихают. Проблема в том, что в твердых образцах помимо молекулярной анизотропии поля Be, которая и является, по сути, объектом исследования в ЯМР, накладываются анизотропии более высокого уровня, свойственные твердому телу. Позже мы поговорим про спин-спиновое взаимодействие, так вот — в данном случае оно портит нам всю малину. Самые приятные образцы — жидкие, в основном это растворы. Растворы обычно содержат достаточно много исследуемого вещества (хотя порой проблемы с растворимостью могут выпить много крови), но при этом изотропны. Конечно, степень изотропности зависит от вязкости, поэтому от раствора, похожего на сироп, разрешенных спектров не ждите, но всё же результат намного лучше и информативнее, чем с твердотельного ЯМР. Как химик-органик, я привык именно к жидкостному ЯМР, о нём в основном и пойдет дальше речь.
Первый вопрос — в чем растворять? Вопрос с подвохом, потому что и вода, и подавляющее большинство органических растворителей, содержат ядра 1Н. А растворителя в образце порядка этак на два больше, чем образца, поэтому сигналы растворителя забьют нам весь спектр. Выход простой, но дорогой — использовать растворители, в которых ядра 1H заменены на ядра 2H. Воду заменяем на тяжелую воду, растворители берем полностью дейтерированные. Стоит это дело, конечно, недешево, самые популярные дейтерорастворители, CDCl3 и DMSO-d6 стоят минимум по 25 и 100 рублей за образец (0.5 мл), против 500 и 1000 рублей за литр у их недейтерированных аналогов. А куда деваться? Некоторые более сложные в производстве дейтерорастворители могут стоить и по нескольку тысяч за образец. Пару раз мне приходилось и самому синтезировать особо дорогие и труднодоступные дейтерорастворители. Бонусом мы получаем кучу ядер дейтерия в образце с заранее известным химсдвигом, по которым можем калиброваться как в процессе съемки, так и при обработке спектров. В принципе, существует опция аппаратного подавления сигналов от растворителя, но во-первых, нормально подавить можно только один сигнал (хлороформ или ацетон подавим, а вот тетрагидрофуран или диметилформамид уже не особо), а во-вторых, туда всё равно придется добавлять 5–10% дейтерированного растворителя для хорошей калибровки. Помимо протонов, в органических растворителях присутствуют ядра 13C, однако они не мешают — шкала химсдвигов у них широкая, чувствительность по этим ядрам низкая, естественное содержание изотопа тоже невысокое.
Сколько растворять? Вопрос не имеет однозначного ответа. Протонный спектр можно записать и с образца, содержащего десятые и даже сотые доли миллиграмма. Но будет долго и шумно. Норма для протонного спектра низкомолекулярного вещества — несколько миллиграмм, чтобы и вязкость раствора не увеличить, и неучтенные межмолекулярные взаимодействия не вылезали. Для съемки спектров на ядрах с меньшей чувствительностью/содержанием, а также для всяких полимеров и биомолекул растворы могут быть и 10–20, и даже 50% в массе образца. С такими образцами, конечно, тяжко, они обычно вязкие как сироп. Но с другой стороны, интенсивность сигнала намного выше.
5 мм ЯМР-ампула в Brucker’овской турбинке.
В рабочем поле ЯМР-магнита категорически запрещено нахождение металлов и в целом проводников, а также непосредственно в активной зоне крайне нежелательно присутствие органических материалов, которые дадут свой сигнал. Поэтому раствор образца помещается в достаточно длинную и тонкую пробирку, которую я привык называть ампулой. Так меня научили олды, которые ещё помнили, как в прибор пихали действительно ампулы. Ампулы в основном изготавливаются из стекла Boro 3.3, как и большая часть химической посуды, но для записи спектрах на ядрах бора, например, приходится использовать кварцевые. Также бывают различные хитрые ампулы — для уменьшенных объемов образца, для работы под инертной средой, ну и так далее. Обычная ампула для рутинных спектров стоит вместе с крышечкой около доллара, хитровыделанные могут стоить и по тысяче. Ампулы, разумеется, многоразовые. Чтобы раствор стал ещё изотропнее, его во время съемки спектра желательно перемешивать. Внутрь ампулы особо ничего не засунешь, магнитную мешалку использовать нельзя, поэтому ампулу раскручивают. Опять-таки никаких активных механизмов рядом с активной зоной особо не напихаешь, поэтому крутят сжатым воздухом, для чего на ампулу надевают турбинку и дуют. Опускают ампулу в активную зону и поднимают наверх, в доступ, также сжатым воздухом. Когда прибор находится в общем доступе, регулярно бывает, что человек, не посмотрев на статус, помещает свой образец в прибор, тот падает вниз и разбивается. А потом прибор приходится чистить (
Итак, мы загрузили образец в прибор, теперь надо как-то снять спектр. Изначально спектры снимали очень просто — банально сканировали интересующий диапазон частот, записывая спектр поглощения, то есть облучали образец, и регистрировали зависимость поглощения образца от частоты. Были спектрометры, в которых меняли частоту при постоянном поле, потом перешли к более простой схеме — менять поле при постоянной наблюдаемой частоте. Однако оба этих варианта были далеки от идеала. Были проблемы и с чувствительностью, и с качеством спектров, и с временем съемки, и с количественными характеристиками спектра. Были даже проблемы, связанные с нагревом образца из-за длительного облучения!
К счастью, довольно быстро прогресс в области вычислительных устройств позволил реализовать быстрые Фурье-преобразования, и, таким образом, перейти на импульсный режим съемки спектров (pump-probe), который довольно быстро вытеснил непрерывный режим и до сих пор остается стандартом для коммерческих спектрометров. В импульсном режиме, первым этапом съемки является облучение образца коротким импульсом радиоволнового излучения на несущей частоте (поляризующий импульс). При достаточно малой ширине импульса проявляется дисперсия частоты, то есть такой импульс представляет собой волновой пакет, в котором содержатся волны разной частоты, причем чем меньше время импульса, тем шире частотный диапазон волнового пакета. А как мы знаем из предыдущего поста, частотный диапазон типичного ЯМР-спектра измеряется максимум сотнями ppm от несущей частоты, поэтому накрыть его таким волновым пакетом не представляет особого труда — длительность импульса, потребного для формирования подобного пакета шириной более чем на порядок превышающего диапазон спектра, измеряется в микросекундах, а мощность в импульсе — в киловаттах. Небольшая ремарка: есть две интерпретации всех этих процессов — электродинамическая, которую любят физики, со всеми этими прецессиями вектора намагниченности, а есть атомно-физическая, которую больше любят химики, и я в том числе. Это не разные теории и не разные модели, а просто разные инструменты для описания. Поэтому мои объяснения будут строиться именно с позиций атомно-физической интерпретации, и не удивляйтесь, если увидите в условной Википедии совсем не те буквы и понятия, что использую я. Просто Википедию писали физики.
Такой пакет, разумеется, возбуждает все ядра целевого изотопа, которые в возбужденном виде стремятся куда-то релаксировать, в том числе и излучательно, т.е. с испусканием обратно радиоволны. Свободная релаксация ядерного возбуждения, как и любая свободная релаксация, подчиняется закону кинетики первого порядка (это на химическом), который выражается как:
dN/dt = kN
то есть в единицу времени релаксирует некая постоянная доля (k) от текущей избыточной заселенности, называемая константой скорости релаксации. Константа эта, кстати, является обратной величиной времени жизни возбужденного состояния ядра τ. Граничное условие, разумеется, выглядит как полная релаксация (N = 0) при времени стремящемся к бесконечности (t → inf), что дает нам типичный exponential decay, сиречь обратноэкспоненциальный спад, избыточной заселенности:
N (t) = N0exp (-kt)
для ядер с разным временем жизни возбужденного состояния. Учитывая, что это спад интенсивности гармонического колебания с частотой ν, соответствующей энергии этого ядра, получаем для каждой частоты итоговую зависимость сигнала (например индуцированного в катушке тока) от времени:
I (t) = I0exp (-kt)*sin (2πνt)
которая выглядит примерно так:
Сигнал в детекторе для одной частоты
Наложение сигналов с разными частотами, начальными интенсивностями и временами релаксации и дают нам результирующий спад свободной индукции (free induction decay, FID). В случае ЯМР спектр регистрируемых частот крайне узок, поэтому наблюдается картина биения гармонических колебаний с характерными веретенообразными доменами. На макроскопическом уровне это выглядит как затухающая прецессия вектора намагниченности образца, который старается прийти в состояние с наименьшей энергией, то есть в сонаправленность с вектором B0. Детектор, в виде ли банальной радиочастотной катушки или же более сложного устройства, регистрирует именно этот самый FID, который выглядит как-то вот так:
FID реального образца из моей коллекции спектров
Далее FID пропускают через жернова преобразования Фурье, который преобразует зависимость I (t) в зависимость I (ν) и спектр приобретает привычный нам вид. В ходе обработки спектра могут применяться различные фильтры, которые несколько улучшают вид спектра, не искажая частотной характеристики и интенсивности пиков. Как устроена система усиления сигнала, я не знаю, и лезть туда не буду. В комментариях к предыдущей части отметился коллега, который понимает, как это работает (с помощью прямого цифрового синтеза), но для меня эти слова всё равно не складываются ни во что знакомое и понятное. Возможно, аудитория Хабра разбирается в этом лучше, всё-таки технарей-электронщиков тут много.
Таким образом, элементарным актом записи ЯМР-спектра является скан, то есть последовательность поляризующий импульс — окно записи FID. Как я уже сказал, ширина поляризующего импульса измеряется в микросекундах, что пренебрежимо мало по сравнению с шириной окна записи. Сколько по времени записывают FID? Для того, чтобы интегральная интенсивность сигналов в спектре была пропорциональна содержанию ядер данного типа в образце, нужно, чтобы за время съемки все ядра успели прорелаксировать полностью. Ну как полностью — обратная экспонента к нулю может только стремиться, но для того, чтобы погрешность количественного анализа не превышала 1%, нужно дождаться релаксации 99% ядер. Для этого достаточно подождать 5 времен релаксации τ самого долгорелаксирующего ядра. Мы не знаем точно, сколько это, и строго говоря, чтобы это узнать, должны проводить релаксометрические измерения на конкретном образце, но для каждого изотопа известен диапазон типичных времен релаксации, и для обычной органики отклонения крайне редки. Для ядер 1Н обычно принимают верхнюю границу τ ~ 100–200 мс, а для ядер 13С уже 1–2 с (с этими ядрами есть нюанс, который позволяет уменьшить окно съемки, но о нем потом). Итого, время скана на ядрах 1H составляет 1–2 секунды, что, согласитесь, немного, при том, что на загрузку-выгрузку образца даже с помощью автосамплера и предварительные манипуляции: подстройку поля до максимальной однородности (shim) и калибровку на внутренний стандарт (lock) тратятся десятки секунд.
Поэтому мы можем себе позволить, чтобы повысить SNR спектра, снять несколько сканов («накопить спектр»), ведь SNR зависит от квадратного корня числа сканов. Для рутинных спектров 1H обычно делается 10–30 сканов, и весь процесс съемки спектра укладывается в минуту, а для спектров на других ядрах это могут быть сотни и тысячи сканов на спектр. Какие-то сложные спектры, с низкой концентрацией образца, могут копить и тысячами сканов, но ввиду корневой зависимости SNR от числа сканов довольно быстро упираешься в то, что дальнейшее повышение SNR дается ценой абсолютно неадекватных временных затрат. Есть ряд ухищрений химического и физического толка, которые позволяют повысить интенсивность сигнала, о некоторых из них мы поговорим далее.
Страх и ужас в импульсных последовательностях. И ведь люди в этом как-то разбираются, ещё и новые последовательности придумывают!
Помимо поляризующего импульса, который придает намагниченность образцу, можно использовать ещё и другие сигналы с разных каналов, которые позволяют этой намагниченностью манипулировать. В базе в спектрометры ставят три катушки — три канала, под различные диапазоны частот. Обычно это калибровочный канал (lock channel), который рассчитан на несущую частоту ядер дейтерия 2H, и два рабочих канала — узкополосный, рассчитанный на ядра 1H, и широкополосный, для других ядер. Используя набор импульсов с рабочих каналах, формируются импульсные последовательности — по сути, программы воздействия радиочастотным сигналом на образец с временной разверткой. Выглядят они ППЦ как страшно, и я не хочу в это лезть, опасаясь что оно меня сожрет.
Про импульсные последовательности и используемые при их построении эффекты мы поговорим в следующий раз, а сейчас, в рассказе о железе, пройдемся по опциям записи спектров с хардварной точки зрения. Во-первых, часто при съемке нужно термостатировать образец. Бывает, некоторые интересные, или наоборот, мешающие равновесия в растворе зависят от температуры, бывает, надо в спектрометре отслеживать протекание химической реакции при определенной температуре, бывает просто надо погреть чтобы растворялось лучше. Из серии спектров ЯМР при разных температурах можно извлекать термодинамические и кинетические параметры различных химических процессов. Греют образцы горячим воздухом, обычно до 100–120 градусов, не выше. Охлаждают потоком выкипающего жидкого газа, обычно азота. Сильно холодить смысла нет, даже при температуре жидкого азота почти все растворители замерзают, а нам этого допускать никак нельзя. Если очень постараться, можно запихнуть в прибор кое-какие дополнительные средства измерения. Например, запихнуть пару оптоволоконных световодов, и присоединить их к спектрофотометру или флуориметру, и снимать одновременно и ЯМР и спектры поглощения/испускания. Есть проточные ячейки, которые позволяют записывать спектры в потоке, например, из проточного реактора или из хроматографа. Вращать такие ячейки не получится, но они и так неплохо гомогенизируются.
Benchtop-NMR на 125 МГц. Для масштаба рядом ноут и рука. Образец помещается в капилляр, объем — несколько микролитров.
Особняком стоят ЯМР-спектрометры на постоянных магнитах, которые в силу компактных размеров и в целом возможности поставить прибор на рабочий стол рядом с компом, называют Benchtop-NMR. Это довольно новая тема, на рынке они появились в заметных количествах максимум лет 10 назад, и с тех пор неплохо там продвинулись. Стоят они в пределах 100 тыс. долларов, что несопоставимо меньше, чем ЯМР на сверхпроводящих магнитах, азот/гелий заливать не надо, образцы меньше по объему т.е. меньше расходуется дорого дейтерированного растворителя. Поэтому стоимость анализа выходит как минимум на порядок ниже, что в первую очередь привлекло коммерческие организации, которым важна рентабельность прибора. Если сверхпроводящий ЯМР для большинства производств и коммерческих R&D был глубоко убыточен, и намного дешевле было снимать спектры на стороне, то теперь позволить себе их могут многие. Конечно, по фундаментальным причинам при прочих равных разрешение и SNR спектров на 125 МГц приборе не сравнится с «взрослым» прибором на 400–500–600 МГц, но для рутины его достаточно. А по удобству использования и цене он безусловно выигрывает. Также эти приборчики в силу размеров и конфигурации, намного легче сопрягаются с жидкостными хроматографами и другими проточными системами, что позволяет осуществлять анализ в online-режиме.
Итак, сегодня мы узнали, как устроен ЯМР-спектрометр, какие образцы он исследует, и что мы имеем на выходе с этого прибора. Ну, а в следующей части уже будет рассказано, какие виды спектров можно снимать и какую химическую информацию из них можно извлечь. Количество материала по теме ЯМР пухнет как на дрожжах. Я наивно полагал, что вмещу весь материал в две части, однако теперь понимаю, что в лучшем случае уложусь в три. Пост, опять же, получился не очень длинный, но времени я на него потратил немало, поэтому буду готовить и выкладывать частями примерно такого размера.
