[Перевод] Спасут ли нас вирусы от супербактерий?
Когда серьёзно больному пациенту не помогли антибиотики, его спас вирус из местного пруда
[не рекомендуется читать текст за едой, а также впечатлительным людям и беременным женщинам — прим. перев.]
Годами Али Ходадуст [Ali Khodadoust] существовал с буквально открытым сердцем. В 2012 году хирурги заменили ему дугу аорты и ненамеренно подсадили бактерию. Бактерия выделяла биоплёнку и пробурила туннель через его грудную клетку, вышедший в результате наружу.
Это была опасная близость. Антибиотики для борьбы с инфекцией, которые старик ежедневно покорно проглатывал, не убивали бактерию. Тогда доктора вставили ему в плечо пластиковую трубку, и подавали антибиотики напрямую в кровоток. Но антибиотики проваливались один за другим. Спустя три года Ходадуста, офтальмолога из Нью Хэйвена, штат Коннектикут, отправили на лечение в Госпиталь Йеля-Нью Хэйвена. Рыжевато-коричневый гной сочился из отверстия диаметром с карандаш у него на груди. Иногда он окрашивался полосками яркой крови. В любой момент бактерия могла попасть в кровоток, вызвать септический шок и убить его.
Для устранения отвратительной бактерии хирургам нужно было отрезать инфицированные ткани, промыть полость сердца и вновь заменить дугу аорты. Но они опасались проводить операции над пожилыми пациентами, особенно в такой ситуации. Они решили, что операция была слишком рискованной, и отложили её. Затем его отвергла ещё одна группа в Техасе. А после отказа в Цюрихском госпитале исчезла последняя надежда Ходадуста.
В то время, как Ходадуст боролся за жизнь, всего в миле от него микробиолог Бенжамин Чен [Benjamin Chan] работал в экспериментальной эволюционной лаборатории. Чен изучал бактериофаги в лаборатории Пола Тёрнера [Paul Turner], профессора экологии и эволюционной биологии в Йельском университете. Бактериофаги, от греческого phagein, это вирусы, пожирающие бактерии. Фаги процветают там же, где бактерии — то есть, практически везде. Ни один организм на Земле не распространён и не разнообразен так, как фаги. Мы соприкасаемся с ними каждый раз, плавая в океане, жуя капустный салат или целуясь. Миллиарды лет эволюции сделали фагов идеальными убийцами бактерий — тихими, скрытными, эффективными. Но что интересно, ни один госпиталь в США сейчас не лечит пациентов фагами.
Тогда ещё Ходадуст не знал об этом, но Чен собирался сделать для него исключение.
Кошмар E. coli: T4 бактериофаг (красный) и его паукообразные нити, используемые для присоединения и инфицирования E. coli.
Однажды днём я сидел с Ченом в его офисе в лаборатории мемориала Осборна, в похожем на кафедральный собор здании на Сайенс-Хилл в Йельском университете (просто мы с ним дружим). Солнце пробивалось сквозь большие окна. Переносная электроплитка на полке была зажата между учебниками по микробиологии. Восседая за своим столом в жилетке, узком галстуке и бледно-лиловых клетчатых носках, выглядывавших из его оксфордов, Чен был больше похож на члена инди-группы, чем на увлечённого микробиолога.
Моё лицо, наверное, скривилось, когда Чен сказал, что планирует инфицировать хрупкий организм 80-летнего пациента экспериментальным вирусом. Он уверил меня: «Фаги инфицируют только бактерий». Частенько фаги вообще атакуют бактерий единственного вида, или несколько его разновидностей. Фаг — ключ сложной конструкции, подходящий к единственной замочной скважине, к рецептору на клеточной стенке бактерии. Когда фаг вскрывает свою жертву, он проталкивает внутрь свой геном и превращает бактерию в машину для копирования фагов. В результате бактерию разрывает, и наружу выходят сотни клонов фага, оставляя останки бактерии. Некоторые фаги действуют менее дерзко, вставляя свой код в ДНК бактерии так, что при каждом воспроизведении бактерии копируется и фаг.
Это сильно отличается от работы антибиотиков. Это неприхотливые обжоры, уничтожающие любые бактерии, включая и то микросообщество, что поддерживает наше здоровье. Фаги же — уточнённые и сдержанные гурманы. Они проникают сквозь липкие биоплёнки, инфицируют своих жертв, и аккуратно уничтожают бактерии и самих себя, оставляя микрофлору пациента нетронутым.
Их уникальный метод работы может позволить им стать грозным оружием в войне против супербактерий — таких, как MRSA, C. diff и CRE, способных, как в случае Ходадуста, ускользать от большинства антибиотиков. Супербактерии таятся в упаковке с курицей в продуктовом магазине, на сиденье поезда, на свежем белье в госпиталях, и каждый год заражают 2 миллиона американцев, 20 000 из которых умирают. Если антибиотики окажутся бессильными и супербактерии возьмут вверх, миллионы рутинных процедур — трансплантация органов, химиотерапия, даже простейший визит к стоматологу — станут потенциально опасными. Фаги могут открыть второй фронт на этой войне. Но, по многим причинам, они этого пока не сделали.
Фаготерапия началась в начале XX века с добровольца, работавшего в Институте Пастера в Париже, собиравшего фекалии. Микробиолог Феликс Д«Эррель выполнял задание по расследованию эпидемии дизентерии, поразившей французских солдат в Первой мировой войне. Интересуясь тем, почему некоторые заболели смертельно, а другие относительно легко переболели, Д«Эррель выращивал фекальные бактерии солдат в лаборатории. Некоторые колонии бактерией в чашке Петри («бактериальные лужайки», как ласково называют их биологи) оказались пятнистыми. В этих местах нечто невидимое убивало бактерий. И в колониях бактерий от поправлявшихся солдат эти точки увеличивались. Он предположил, что эти невидимые «микробы иммунитета» могут помогать восстановлению пациента.
Для проверки своей теории Д«Эррель собрал этих микробов — они с женой назвали их фагами — и подсадил их 12-летнему больному дизентерией. Пациент быстро восстановился. Вдохновлённый этим, Д«Эррель открыл в Париже Лабораторию бактериофагов. Словно парфюмер, смешивающий запахи для разных случаев, он смешивал и продавал фагов против диареи, кожных заболеваний и простуд. Это занятие вышло за пределы Франции — Д«Эррель ездил в Грузию и помогал основать институт Элиавы, осуществлявший фаготерапию в 1923 году, а в 1940-х компания Eli Lilly продавала различные лекарства на основе фагов в США.
Это был хороший старт многообещающей терапии. Но ещё одно научное открытие подавило интерес к фагам. В 1928 году Александр Флеминг случайно нашёл пенициллин в плесени благодаря беспорядку, царившему в его лаборатории. Пенициллин стал волшебным лекарством: его не надо было изготавливать, как фагов, он стабильно работал, его можно было производить в больших количествах, и он мог храниться месяцами. Он также появился как раз вовремя: ко Второй мировой войне. Фаги же казались невидимым и капризным побочным продуктом бактерий, иногда лечившим инфекции, но часто не работавшим. До эпохи ДНК и молекулярной биологии было даже неизвестно, чем они являлись. К 1940-м антибиотики уже производились в промышленных масштабах в США и Европе. Фаги оказались в пыльном шкафу среди медицинских изгоев.
Но антибиотики не везде встречал одинаковый энтузиазм. В СССР они были дорогими. И в то время, как в Западной Европе исследование фагов затихло, оно продолжалось в сети советских лабораторий под руководством Института Элиавы. К 1980-м грузинские лаборатории выдавали еженедельно по две тонны спреев, порошков и пластырей с фагами. Большая часть продукции поступала в военку. Но исследования публиковались на русском и польском языках, и не проникали в США.
Но в западных лабораториях молекулярной биологии фагов подробно изучали. Там установили, что гены состоят из нуклеиновых кислот, а не из белков, и открыли механизмы управления генами. Биологи добыли фагов для многих ферментов, используемых в современных лабораториях. А в 1976 году первым расшифрованным геномом был геном фага. Эффективная и спорная технология редактирования генов CRISPR-Cas была придумана на основе защиты бактерий от фагов. В итоге в США началось возрождение фагов, в частности из-за начала научного обмена между учёными США и России.
Чен начал охотиться на фагов в OmniLytics, одной из компаний, продававших фагов фермерам. Там Чен искал фагов для защиты скота от Escherichia coli O157: H7, а помидорных плантаций от заболеваний растений. По словам Чена, мы уже постоянно употребляем фагосодержащие продукты. Сосиски и мясо для бутеров обрабатывают средством «Listex», коктейлем из нескольких фагов, одобренным FDA в 2006 году, защищающем от листерий. Конкурент, компания Intralytix, предлагает спрей «SalmoFresh», атакующий сальмонеллу, заражающую птицу, фрукты и овощи. Фагов, в отличие от пищевых добавок, не обязательно упоминать на упаковке — так что покупателю сложно узнать, потребляет ли он вирусный спрей. Фаговые спреи органические, и Omnilytics рекламирует фагов как вкусную и естественную альтернативу пестицидам.
Когда Чен пеерехал в Нью Хэйвен в 2013, он хотел изучать потенциал фагов в качестве лекарств для людей. Он написал президенту госпиталя Йеля-Нью Хэйвена, что охотится за фагами и ему нужен пациент. Довольно быстро Чен встретился с доктором Ходадуста, Дипаком Нарайаном [Deepak Narayan], забрал свой приз (пробирка с замороженным гноем) и познакомился со своей бактериальной целью. Он посеял её в смеси бульона с агаром. Бактерия Ходадуста, Pseudomonas aeruginosa, росла яростно и быстро. «Пахнет она неплохо, похоже на виноградный ароматизатор», сказал мне Чен. Он заполнил холодильник пробирками с бактерией и проверял на ней различные антибиотики. Бактерия показала свою стойкость, и тогда Чен начал поиски фага, который бы смог её убить.
Разнообразие фагов перекрывает разнообразие всей остальной жизни на Земле. Везде, где бы ни искали учёные — в почве, в пещерах, в глубинах океана — они находят миллионы новых фагов. Размером они не превышают 100 нм, а всего их на планете живёт примерно 1032. Если бы фаги были размером с песчинку, ими можно было бы засыпать 1000 таких планет, как Земля. Для охотников за фагами нет никаких карт, где было бы указано место нахождения вирусного клада. Разыскиваемый Ченом фаг мог оказаться везде, где живут Pseudomonas — в людях, в госпиталях, в природе.
Чен искал везде, и не гнушался просьбами к приятелям и коллегам поделиться пробами их собственных фекалий. Другие биологи института помогали Чену. «Рыбоведы с верхнего этажа» — экологи, исследовавшие пресноводную форель — поделились с Ченом пробами из рек Новой Англии. Чен собрал десятки проб из озёр, луж, канализаций, компоста и почвы. В каждой крохотной пробирке было множество бактерий и фагов.
В лаборатории Чен смешивал каждый образец с несколькими каплями Pseudomonas bacteria. Только подходящий фаг мог заразить их клетки и размножиться. Словно винодел, фильтрующий шкурки, семена и листья винограда из вина, Чен пропускал смесь через фильтр в 100 раз мельче толщины человеческого волоса. Оставался лишь очищенный «нектар» — набор фагов.
И для проверки способности нектара убивать Pseudomonas, а не просто размножаться в них, он смешивал Pseudomonas от Ходадуста с очищенными фагами, выкладывал их в чашки Петри и выращивал культуры. Если бы фаг успешно внедрился в клетки бактерии, на бактериальной лужайке образовалось бы характерное пятно.
Однажды поздно вечером, через несколько месяцев, Чен нашёл нужных фагов. Стоя в одиночестве в своей готического вида лаборатории с высокими потолками, он с недоверием рассматривал чашку Петри, которую держал в защищённых перчатками руках. Ясно видимые круги выделялись на изумрудном фоне чашки, будто планеты разного цвета на тёмном небе. Он держал в руках бактериальное кладбище. После приготовления сотен чашек с Pseudomonas и добавления тщательно изготовленной пробы, он нашёл фаг-ключ, способный отомкнуть бактерию Ходадуста, ворваться в неё и учинить хаос.
Он посмотрел на маркировку на чашке Петри. Пруд Додж. Всё благодаря «рыбоведам сверху». Вода из пасторального пруда в Коннектикуте взрастила убийц бактерий, более способных, чем сильнейшие антибиотики. Чен быстро убедился, что его фаг-убийца также мог проникать через защитную биоплёнку, возведённую бактериями Pseudomonas на искусственной аорте Ходадуста.
Настало время самого сложного теста — не будут ли Pseudomonas эволюционировать и сопротивляться фагу? Не существует защищённых от эволюции терапий. Один из главных аргументов против фагов состоит в том, что эта терапия провалится так же, как антибиотики. Бактерии могут выработать сопротивляемость к фагам. Поэтому фагов часто применяют в смесях. В идеале, если бактерия выработает сопротивляемость к одному из них, другие сделают свою работу. Как и ожидалось, за ночь бактерия выработала иммунитет. Но не было ли у бактерии, сопротивлявшейся фагам, слабого места? Чен посеял новую устойчивую бактерию и добавил антибиотик цефтазидим. На следующее утро в этом месте образовалось прекрасное пятно смерти.
Pseudomonas выработали сопротивляемость, избавившись от рецепторов, через которые проникали фаги из пруда. Но без них бактерии стали уязвимыми. Эти рецепторы играют другую важную роль — выкачивают из клетки антибиотики. Когда Чен добавил антибиотики, то лекарство, ранее неэффективное, легко проникло через клеточную стенку. А без способности откачать их, Pseudomonas оказались отравленными изнутри. Комбинация фагов из пруда и цефтазидима поставила эволюции мат.
Вновь выйдя на поверхность в США, фаги сталкиваются с новыми препятствиями для использования их в медицине, не последним из которых является одобрение FDA. «Фаги вроде бы работают, говорит Рэндал Кинкейд [Randall Kincaid], главное должностное лицо по науке в объединении Национальные институты здравоохранения США. — Но у нас нет хорошей статистики по аккуратным научным исследованиям, которая бы говорила, что именно фаги стали причиной выздоровления. Нам нужно думать об этом с точки зрения докторов. Когда пациент приходит к доктору с бактериальной инфекцией, принято лечить его антибиотиками. Нам нужны недвусмысленные доказательства преимуществ фагов, чтобы принять их».
Было проведено несколько успешных клинических испытаний. Фазы I и II испытаний, проведённых AmpliPhi Biosciences Corporation, выявили, что одна доза коктейля из фагов хорошо помогла против ушных инфекций Pseudomonas aeruginosa, устойчивых к антибиотикам. Другое испытание фазы I обнаружило, что коктейль из фагов, предназначенный для лечения язв ног, был безопасен, но не смог значительно ускорить выздоровление пациента (на фазах I проверяется безопасность лекарств, на фазах II — эффективность).
Но пока ещё не проведено ни одного испытания фазы III — конечного этапа, подтверждающего эффективность медицины, для которого требуется не менее 1000 пациентов. Поскольку принцип работы фагов кардинально отличается от антибиотиков, неясно, как оценивать их эффективность. Кевин Оттерсон, профессор юридических наук в Юридической школе Бостонского университета, и исполнительный директор акселератора CARB-X, собирающегося влить $350 млн в разработку новых продуктов для борьбы с супербактериями, говорит, что «с антибиотиками понятно, какие доказательства нужно получить в экспериментах с животными, и какие исследования проводить на людях. Как должен выглядеть эксперимент с фагами — вопрос очень открытый».
Некоторые преимущества фагов порождают проблемы, волнующие регуляторов и критиков. Главная — специализация, которая делает их точными инструментами, но при этом означает, что клинические испытания должны подтверждать безопасность и эффективность для каждого вида бактерий. Антибиотики широкого профиля часто прописывают без уточнения диагноза, а лечение фагами требует точного установления вида бактерий. Это может изменить ход процедуры обследования. Вопрос с дозировкой в случае фагов также усложняется. Антибиотики проходят по телу и подвергаются метаболизму предсказуемыми путями. Фаги — это не мёртвые вещества. Если они найдут свою бактерию, то начнут размножаться. Это значит, что иногда будет достаточно и одной дозы фагов, но также это значит, что их активность сложно предсказать. Сколько фагов дать пациенту? Как быстро бактерии выработают сопротивляемость? Даже когда фаги прекрасно ведут себя in vitro, сложно предсказать, как они будут действовать in vivo, в сложном и непростом для навигации окружении человеческого тела.
Ещё один неприятный вопрос: кто будет платить за клинические тесты? Они часто стоят сотни миллионов долларов. По сравнению с лекарствами от рака, говорит Кинкейд, «для лечения инфекционных заболеваний не такие уж большие доходы по инвестициям». Сейчас сложно продать идею фагов инвесторам, желающим получить гарантию успеха. Фаги, набранные из канализации и компоста, это природный продукт и их нельзя запатентовать. Компании могут обойти этот момент, патентуя коктейли или создавая фаги в лаборатории. «Здесь большую роль играет прецедент», говорит Кинкейд, годами управлявший биотехнологической компанией до текущей работы в NIH. «Инвесторам не нравятся возможные капризы неизвестных нам вещей». Он считает, что правительству нужно вмешаться в ускорение и финансирование исследований фагов.
Крупнейшим тестом фаготерапии на сегодня стал PhagoBurn, стоивший европейской комиссии €3,8 млн, и он столкнулся с несколькими проблемами. Изначально в него хотели привлечь 220 человек с ожогами и инфицированными ранами из 11 различных госпиталей Франции, Бельгии и Швейцарии. Планировалось проверить эффективность двух разных коктейлей из фагов по сравнению с обычным антибиотиком, сульфадиазином серебра. После того, как учёным с трудом удалось доказать стабильность фагов в коктейлях, они столкнулись с трудностями в поиске пациентов. Для тестов требовались люди, инфицированные либо Escherichia coli, либо Pseudomonas aeruginosa, но не обеими одновременно. Но жертвы ожогов часто заражаются многими патогенами. Нашлось всего 15 пациентов для исследования Pseudomonas aeruginosa. А вариант с E. coli пришлось вообще отбросить. Уменьшенный вариант теста продолжается, результаты будут известны следующей весной — через четыре года после его начала.
Есть и те, кто отвергает фаготерапию. Стив Проян [Steve Projan], старший вице-президент по исследованиям и развитию, и глава отдела инфекционных заболеваний и вакцин в биотехнологической компании MedImmune, ранее работавший в Novartis and Wyeth, так написал об этом в статье 2004 года: «Личные и анекдотические рассказы бывших пациентов, которым 'помогла' фаготерапия, смешные и грустные одновременно — по очевидным причинам, мы ничего не услышим от тех пациентов, инфекции которых вылечить не удалось». Проян пишет, что вместо попыток преодоления всех препятствий фаготерапии, деньги можно было бы потратить лучше — например, на разработку «терапий с малыми молекулами», включая и антибиотики. Он отказался давать интервью.
Другие же более оптимистичны. Несколько стран Восточной Европы штатно используют фаготерапию. Институт им. Людвига Хирцфелда в Варшаве, Польша, использует фагов в качестве последнего средства, для пациентов, кому не помогли антибиотики. С 1980-го там лечили более 1500 пациентов, заражённых устойчивыми к лекарствам бактериями, и институт сообщает, что «большую часть из них удалось вылечить». В Грузии фаги используются ещё шире. Доктора лечат около 20% поступающих пациентов при помощи фагов. Центр фаготерапии в Тбилиси привлекает пациентов со всего мира, страдающих от неизлечимых инфекций мочевых путей, акне, муковисцидоза, кишечных инфекций. Центр утверждает о 95% успешности лечения. Но многие западные учёные сомневаются в этом, поскольку их не проверяли ни FDA, ни Европейское медицинское агентство.
И ещё есть Ходадуст и Чен.
Через несколько месяцев после успеха Чена в лаборатории, настало время попробовать лечение на Ходадусте. Его привели в процедурную комнату в Йель-Нью-Хейвенском госпитале, и двое медиков вкатили тележку с реанимационным оборудованием. Чен рассказал, что его тогда накрыла волна паники. Перед небольшой аудиторией из хирургов и студентов радиолог ввёл небольшое количество смеси из солёной воды, фагов и антибиотиков, в грудную полость Ходадуста. Чен неотрывно следил за зигзагами аппарата, отмечавшего сердцебиение пациента. Каждый зазубренный сигнал говорил о том, что доставка вируса прямо к сердцу пациента его не убила. Черезь день Ходадуста выписали. Никаких очевидных изменений в его состоянии не наблюдалось.
Чан не знал, расстроился он или успокоился. «Я волновался, что убью человека. Либо фаготерапия сработает — невероятно — либо всё пойдёт плохо — ужасающе плохо».
Несколько недель Чену не поступало сообщений. Через месяц Нараян сообщил Чену, что Ходадуст отправился на самолёте навестить родственников за границей. Чувствовал ли он себя так хорошо, чтобы путешествовать, или он решил повидаться с семьёй перед смертью?
Затем, через шесть месяцев после процедуры, без предупреждения, Ходадуст пришёл в клинику Нараяна. Его грудь полностью зажила, вместо дыры была ровная поверхность. Обычно молчаливый Нараян сказал Чену, что его пациент выглядел «на миллион долларов». В первый раз за три года он не принимал антибиотики. Никаких побочных эффектов замечено не было.
Нараян не может быть уверен, что выздоровление Ходадуста произошло благодаря фаготерапии. В идеальном мире он изучал бы его после операции, отслеживал бы состояние полости, тестировал всё, что оттуда сочилось, на наличие Pseudomonas. Но он уверен, что его пациенту помогли фаги из пруда Додж. Он узнал, что через пять недель после терапии некая группа хирургов приняла Ходадуста, чтобы удалить часть трансплантата, удерживавшего его новую аорту. Они протестировали трансплантат, и тот уже не содержал Pseudomonas. Он впервые за три года перестал принимать антибиотики, и инфекция так и не вернулась. Вирус из пруда, находящегося всего в 60 километрах от его дома, дал ему новый шанс — и новый смысл термину «местные лекарства».
Чен, Нараян и Тёрнер отметили это дело, погрузившись в написание научных работ. Они надеются спланировать клинические испытания смеси фагов из пруда Доджа с цефтазидимом. Но перед испытаниями на людях фагов нужно проверить на крысах. Команда использует доклинические услуги NIH для проведения тестов in vivo на животных.
А в это время Чен собирает библиотеку фагов. Если вы живёте в Нью Хэйвене, или недавно пользовались тамошними туалетами, вы можете стать невольным донором. Он еженедельно посещает станцию очистки воды Ньюю Хэйвена, берёт пробы веществ, приходящих из туалетов со всего города, фильтрует из них фагов и проверят их на множестве чашек Петри, содержащих потенциальные супербактерии. Охота уже принесла успехи. Чен изолировал фагов для Klebsiella pneumoniae и Enterococcus faecalis, устойчивых к антибиотикам, и вызывающих инфекцию мочевых путей. Во время последней поездки за фагами на Гаити Чен нашёл фага, атакующего бактерию холеры, Vibrio cholerae.
Иногда из экскрементов одного человека можно приготовить коктейль из фагов для другого.
